醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)十 腸桿菌科

實(shí)驗(yàn)十  腸桿菌科

腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和動(dòng)物腸道中、生物學(xué)性狀相似的革蘭陰性桿菌。多數(shù)為腸道的正常菌群，但在機(jī)體免疫力低下或寄居部位發(fā)生改變時(shí)可引起感染。根據(jù)其生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)、DNA同源性等可將腸桿菌科分為120多個(gè)菌種，其中與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的有埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬等。

一、大腸埃希菌

大腸埃希菌(E. coli)俗稱大腸桿菌，是寄居于人和動(dòng)物腸道的正常菌群。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降、該菌侵入腸外組織或器官，可引起急性炎癥或繼發(fā)感染；有些血清型可引起腹瀉。從水和食品中檢出較多大腸桿菌時(shí)，可判斷它們已被糞便污染。因此，大腸桿菌常被作為飲水、牛乳及食品的衛(wèi)生學(xué)檢測指標(biāo)。

（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性

【材料與方法】

1．大腸桿菌革蘭染色標(biāo)本片。

2．大腸桿菌普通瓊脂平板、SS平板、中國藍(lán)平板、伊紅美藍(lán)(EMB)平板培養(yǎng)物。

【結(jié)果】

1．大腸桿菌為革蘭陰性、中等大小桿菌，兩端鈍圓或稍彎曲，呈分散排列。

2．菌落特征(表10-1)。

表10-1  大腸桿菌在普通瓊脂平板及選擇鑒別培養(yǎng)基上的菌落特征

培 養(yǎng) 基 菌 落 特 征

普通瓊脂平板  圓形，中等大小，灰白，整齊，光滑菌落

SS平板呈紅色

中國藍(lán)平板  呈藍(lán)色

伊紅美藍(lán)平板呈紫黑色，有金屬光澤

（二) 生化反應(yīng)

【材料與方法】

1．取大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2．取大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌分別接種于雙糖鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

3．靛基質(zhì)產(chǎn)生、甲基紅、VP、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(IMViC試驗(yàn))，見實(shí)驗(yàn)四。

【結(jié)果】

大腸桿菌生化反應(yīng)結(jié)果(表10-2)。

表10-2  大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌5種糖發(fā)酵、雙糖鐵、IMViC試驗(yàn)結(jié)果

 上 層   下 層

葡   乳   麥   甘  蔗  吲哚  甲基紅  VP 枸櫞酸鹽

 乳  H₂S  葡  動(dòng)力

大腸桿菌  ⊕  ⊕  ⊕  ⊕  d   +　 -　 ⊕   +     +  +  - -

產(chǎn)氣桿菌  ⊕  ⊕  ⊕  ⊕  +   +   -   ⊕   +     -  -  + +

二、沙門菌屬

沙門菌屬(Salmonella)為一群生化反應(yīng)、抗原結(jié)構(gòu)相似的革蘭陰性桿菌，血清型別繁多，對人致病的有傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌、希氏沙門菌、腸炎沙門菌，鼠傷寒沙門菌和豬霍亂沙門菌等，可引起人致傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病。

（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性

【材料與方法】

1．傷寒沙門菌革蘭染色標(biāo)本片、鞭毛染色標(biāo)本片。

2．傷寒沙門菌，甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌在普通瓊脂平板，中國藍(lán)平板，SS平板，伊紅美藍(lán)平板18~24h培養(yǎng)物。

【結(jié)果】

1．傷寒沙門菌為革蘭陰性桿菌，分散排列，鞭毛呈粗大、大波浪形。

2．菌落特征：傷寒、副傷寒沙門菌菌落特征一致(表10-3)。

表10-3  傷寒、副傷寒沙門菌在普通瓊脂平板、選擇鑒別培養(yǎng)基上的菌落特征

培  養(yǎng)  基菌 落 特 征

普通瓊脂平板   圓形，中等大小，灰白，半透明，邊緣整齊光滑

SS平板  較小，淡黃色，半透明

中國藍(lán)平板 較小，淡紅色半透明

伊紅美藍(lán)平板  較小，無色，半透明

（二) 生化反應(yīng)

【材料與方法】

1．取傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2．取傷寒沙門菌，甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌分別接種于雙糖鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

3．吲哚試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)見實(shí)驗(yàn)四。

【結(jié)果】

生化反應(yīng)結(jié)果(表10-4)。

表10-4  傷寒、副傷寒桿菌主要生化反應(yīng)結(jié)果

細(xì)菌    葡   乳   麥   甘   蔗   動(dòng)力  H₂S  吲哚   尿素

傷寒桿菌  +  -   + +  - +  +  -   -

甲型副傷寒桿菌  ⊕    -   ⊕   ⊕ - +  d  -   -

肖氏沙門菌   ⊕   -   ⊕   ⊕ - +  + 執(zhí)業(yè)藥師 -   -

（三) 肥達(dá)(Widal)試驗(yàn)

【原理】

用已知的傷寒沙門菌O、H抗原和甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌、希氏沙門菌H抗原的診斷菌液與待檢血清作定量凝集試驗(yàn)，以測定待檢血清中有無相應(yīng)抗體存在，作為傷寒、副傷寒診斷的參考，一般間隔5～7d重復(fù)采血檢查，如抗體效價(jià)隨病程進(jìn)展而上升，即有診斷價(jià)值。

【材料】

1．傷寒沙門菌O、H抗原菌液，甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌H抗原菌液，生理鹽水，待檢血清。

2．試管、1ml吸管、試管架、37℃水浴箱等。

【方法】

1．取清潔試管32支，分成4排，每排8支，依次編號(表10-5)。

2．于試管內(nèi)各加入生理鹽水0.5ml。

3．在每排第1管各加1∶10的待檢血清0.5ml，用1ml吸管吹吸數(shù)次，充分混勻，吸出0.5ml注入第1排第2管作對倍稀釋，依次稀釋至第7管，從第7管吸出0.5ml棄去，第8管為對照。同法將第2、3、4排依次作對倍稀釋。

表10­-5  肥達(dá)氏反應(yīng)操作程序  (單位：ml)

管  號1  2   3   4   5   6   7   8

生理鹽水 0.5 0.5  0.5 0.5  0.5  0.5 0.5 0.5

1∶10待檢血清  0.5 0.5  0.5 0.5  0.5  0.5 0.5  棄去0.5

診斷抗原 0.5 0.5  0.5 0.5  0.5  0.5 0.5 0.5

血清稀釋度1:40   1:80 1:160  1:320   1:640  1:1280  1:2560   -

結(jié) 果

4．從第8管開始，從后向前，于第1排各管內(nèi)加入傷寒沙門菌H抗原菌液0.5ml；于第2排各管內(nèi)加入傷寒沙門菌O抗原菌液0.5ml；第3排各管分別加入甲型副傷寒沙門菌H抗原菌液0.5ml；第4排各管內(nèi)分別加入肖氏沙門菌H抗原菌液0.5ml。

5．加完菌液，振蕩試管架，混勻，置37℃水浴箱孵育16～18h后觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

凝集程度，以“+”多少表示。

+ + + +   最強(qiáng)，上液澄清，細(xì)菌全部凝集于管底。

+ + +  強(qiáng)，上液輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集于管底。

+ +   中強(qiáng)，上清半混濁，細(xì)菌部分凝集。

+  弱，上液混濁，細(xì)菌少部分凝集。

-  不凝集，液體呈乳狀與對照管相同。

效價(jià)判定：對照管均不發(fā)生凝集時(shí)，依次觀察試驗(yàn)管。以使凝集呈“+ +”反應(yīng)的血清最高稀釋度為其凝集效價(jià)。

三、志賀菌屬

志賀菌屬(Shigella)是細(xì)菌性痢疾的病原菌，俗稱痢疾桿菌。細(xì)菌由消化道侵人腸道，靠侵襲力和毒素致病，毒素入血可引起毒血癥。

本菌屬的形態(tài)特點(diǎn)為革蘭陰性桿菌，無鞭毛，但菌體周圍有菌毛。除宋內(nèi)志賀菌個(gè)別菌株遲緩發(fā)酵乳糖外，均不分解乳糖。根據(jù)生化反應(yīng)及抗原不同可分為四群：A群(痢疾志賀菌)，B群(福氏志賀菌)，C群(鮑氏志賀菌)，D群(宋內(nèi)志賀菌)。目前，我國以福氏志賀菌最多見，宋內(nèi)志賀菌逐年增多，其他較少見。

（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性

【材料與方法】

1．痢疾桿菌革蘭染色片。

2．痢疾桿菌普通瓊脂平板，中國藍(lán)平板，SS平板，EMB平板培養(yǎng)物。

【結(jié)果】

1．為革蘭陰性桿菌，分散排列。

2．菌落特征，同傷寒沙門菌。

注：宋內(nèi)志賀菌個(gè)別菌株可遲緩發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)2～10d，菌落特點(diǎn)可接近大腸桿菌菌落特點(diǎn)。

（二)生化反應(yīng)特性

【材料與方法】

1．葡萄糖、乳糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)。

2．雙糖鐵培養(yǎng)試驗(yàn)。

3．吲哚試驗(yàn)。

【結(jié)果】

生化反應(yīng)結(jié)果(表10-6)。

表10-6   痢疾桿菌糖發(fā)酵、雙糖鐵、吲哚試驗(yàn)結(jié)果

　　 細(xì)　菌   葡 乳 麥 甘 蔗   動(dòng)力 H₂S  吲哚

痢疾志賀菌  　+  -  +  -  d  -   - 　d

福氏志賀菌  　+  -  +  +  d  - 　- 　d

宋內(nèi)志賀菌  　+  ﹡ +  +   　+  -   -   　 -

注:  ﹡： 遲緩發(fā)酵；＋：產(chǎn)酸；－：不發(fā)酵；d：某些菌株陽性

四、糞便標(biāo)本中致病性腸道桿菌的分離與鑒定

正常情況下腸道中有多種細(xì)菌寄生，包括大量的厭氧菌和大腸桿菌、變形桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌等。本實(shí)驗(yàn)的目的主要是分離沙門菌屬及志賀菌屬中的某些致病菌。

【標(biāo)本采集】

糞便中細(xì)菌極多，為此，糞便的微生物學(xué)檢查常根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康木�的不同而選擇不同培養(yǎng)基或用適當(dāng)方法處理，盡可能地抑制雜菌，以利于病原菌的檢出。但并不是糞便標(biāo)本的采集無須注意雜菌污染。若便器或標(biāo)本盛器不潔而污染了變形桿菌，就可能影響病原菌的分離檢出，甚至把污染菌誤報(bào)造成誤診。

1．自然排便采集  自然排便后，挑取其膿血或粘液部分2～3g，液狀糞便取絮狀物2～3ml,置于滅菌容器內(nèi)送檢。

2．直腸拭子采集  如不易獲得糞便時(shí)，或排泄困難患者及嬰兒，可用直腸拭子采取。即用滅菌棉拭經(jīng)生理鹽水或甘油緩沖鹽水濕潤后，插入肛門內(nèi)4～5cm(幼兒2～3cm)處，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一圈拿出，插入滅菌試管內(nèi)送檢。

3．標(biāo)本如不能立即送檢，可將其保存于30％甘油緩沖鹽水或?qū)ｉT運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)。

【分離培養(yǎng)程序】

自糞便中分離培養(yǎng)細(xì)菌需連續(xù)4d進(jìn)行試驗(yàn)(圖10-1)。

糞便或直腸拭子  分離培養(yǎng)(SS、MAC)

 37℃、18～24h

  可疑菌落

  初步鑒定 (雙糖鐵/尿素培養(yǎng)基)

 系列生化反應(yīng)

  最終鑒定——

 血清學(xué)鑒定

圖10-1 糞便標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢查程序

第1日：

取糞便標(biāo)本用SS平板作分區(qū)劃線接種，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落特征。

腸道致病菌不分解乳糖，所以在SS平板上生長的菌落為無色透明的小菌落。如能產(chǎn)生H₂S，則菌落中心呈黑色。大腸桿菌在SS平板上一般不生長，但如糞便標(biāo)本接種得多，大腸桿菌量多所以仍有少數(shù)生長。大腸桿菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，菌落呈紅色，或菌落中心顯紅色，很容易和致病菌區(qū)分。

第2日：

觀察SS平板上菌落，用接種針挑取可疑菌落分別接種于雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基中、尿素培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。

第3日：

觀察半固體-雙糖鐵培養(yǎng)基結(jié)果。如果雙糖鐵培養(yǎng)基中乳糖不發(fā)酵，可能為腸道致病菌。根據(jù)葡萄糖發(fā)酵結(jié)果、運(yùn)動(dòng)力的有無等可初步判定為哪一類細(xì)菌。最后鑒定該菌尚需自雙糖鐵培養(yǎng)基上取材做以下試驗(yàn)。

1．革蘭染色。

2．接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖單糖發(fā)酵管，蛋白胨水及其他培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～24h。

3．選用已知抗血清作玻片凝集試驗(yàn)。

第4日：

表10-7  糞便中常見腸桿菌主要生化反應(yīng)簡明鑒定表

雙  糖  鐵   葡  乳  麥  甘  蔗  吲  甲  V  枸   尿

櫞

上  下  硫  動(dòng)  萄   芽  露基   酸

  化 

層  層  氫  力  糖  糖  糖  醇  糖  哚  紅  P   鹽   素

大 腸 桿 菌  ＋  ⊕ －  ＋  ⊕ ⊕  ⊕  ⊕ d   ＋  ＋  －  －   －

產(chǎn) 氣 桿 菌  ＋  ⊕ －  ＋  ⊕ ⊕  ⊕  ⊕ ＋  －  －  ＋  ＋   －

普通變形桿菌 －  ⊕ ＋  ＋  ⊕ －  ＋  －  ＋  ＋  ＋  －  －   ＋

傷 寒 沙門菌 －  ＋  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  －  －  ＋  －  －   －

甲型副傷寒沙門菌   －  ⊕ d   ＋  ⊕ － ⊕  ⊕  －  －  ＋  －  －   －

肖 氏 沙門菌 －  ⊕ ＋  ＋  ⊕ － ⊕  ⊕  －  －  ＋  －  d －

希 氏 沙門菌 －  ＋  ＋  ＋  ＋  －  ＋  ＋  －  －  ＋  －  ＋   －

痢 疾 志賀菌 －  ＋  －  －  ＋  －  ＋  －  d   d   ＋  －  －   －

福 氏 志賀菌 －  ＋  －  －  ＋  －  ＋  ＋  d   d   ＋  －  －   －

鮑 氏 志賀菌 －  ＋  －  －  ＋  －  ＋  ＋  －  d   ＋  －  －   －

宋 內(nèi) 志賀菌 ﹡  ＋  －  －  ＋  ﹡  ＋  ＋  ＋  －  ＋  －  －   －

注：﹡：遲緩發(fā)酵；＋：產(chǎn)酸；⊕：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；－：不發(fā)酵；d：某些菌株陽性

1．觀察單糖發(fā)酵及其他培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果。

2．根據(jù)以上各試驗(yàn)結(jié)果，判定被檢糞便中分離的腸道致病菌是哪一種細(xì)菌(表10-7)。

附錄

1．SS瓊脂平板

沙門志賀菌屬瓊脂(salmonella Shigella agar，簡稱SS agar)是一種用于沙門菌和志賀菌分離培養(yǎng)的選擇鑒別培養(yǎng)基。由于有膽鹽，能部分地抑制大腸桿菌生長，但能促進(jìn)沙門菌、志賀菌生長的作用，有利于致病菌的分離。

成分：

蛋白胨5g

牛肉膏5g   基礎(chǔ)培養(yǎng)部分

瓊脂 18g

乳糖 10g   鑒別乳糖是否發(fā)酵

0.5%中性紅水溶液   4.5ml

膽  鹽  10g

枸櫞酸鈉  10～14g   抑制革蘭陽性菌、大腸桿菌

0.1%煌綠水溶液 0.33ml

硫代硫酸鈉   8.5～10g

枸櫞酸鐵　   0.5g 鑒別H₂S的產(chǎn)生

蒸餾水  1000ml

作用：

由于此培養(yǎng)基能抑制部分大腸桿菌生長，而對沙門菌和痢疾桿菌無影響，所以作分離培養(yǎng)時(shí)，標(biāo)本的接種量可以大一些，有利于致病菌的分離。在此培養(yǎng)基上沙門菌、痢疾桿菌不發(fā)酵乳糖，為無色的小菌落，而大腸桿菌能發(fā)酵乳糖呈紅色的菌落。

2．雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基

雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基是一種復(fù)合性的檢查生化反應(yīng)的培養(yǎng)基，可檢查4種反應(yīng)即葡萄糖、乳糖的發(fā)酵反應(yīng)，是否產(chǎn)生H₂S，有無動(dòng)力等(表10-8)。

成分：

下層： pH 7.6蛋白胨水  500ml

 葡萄糖1g

 瓊 脂1.75g

 酚 紅  0.012g

斜面： pH 7.6蛋白胨水  500ml

 硫代硫酸鈉0.1g

 硫酸亞鐵銨0.1g

 乳 糖5g

 瓊 脂 6.5g

 酚 紅  0.012g

表10-8  幾種腸道桿菌在雙糖鐵一半固體培養(yǎng)基中的反應(yīng)

作用：

一般認(rèn)為沙門菌屬和志賀菌屬是主要的腸道致病菌。這兩屬細(xì)菌都能發(fā)酵葡萄糖，但一般不能發(fā)酵乳糖。與此相反，腸道條件致病菌中的大腸菌屬和克雷伯菌屬則能發(fā)酵乳糖，由此可見乳糖是否被利用是區(qū)別腸道致病菌和條件致病菌的關(guān)健�？衫�用雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基初步鑒別腸道致病菌與非致病菌。