第十章 高效液相色譜法
第一節(jié) 概述
高效液相色譜法（high performance liquidchromatography, HPLC)是以高壓輸出的液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)方法而發(fā)展起來的一種分離分析方法。
一、高效液相色譜法的特點(diǎn)
高效液相色譜法以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，但又不同于經(jīng)典液相色譜法。與經(jīng)典液相色譜法相比，具有如下特點(diǎn)：
1.高效 由于使用了極細(xì)顆粒的固定相和均勻填充技術(shù)，高效液相色譜的分離效率極高，柱效可達(dá)每米105理論塔板數(shù)。
2.高速 由于采用高壓泵輸送流動(dòng)相，使流動(dòng)相流速大大加快，流速最高可達(dá)10 ml/min，完成一次分離分析一般只需幾分鐘到幾十分鐘，比經(jīng)典液相色譜法快得多。
3.高靈敏度 紫外、熒光、電化學(xué)以及質(zhì)譜等高靈敏度檢測(cè)器的使用，使高效液相色譜的檢測(cè)限可達(dá)10-9～10-11 g。
4.高自動(dòng)化 智能化的色譜專家系統(tǒng)結(jié)合自動(dòng)進(jìn)樣裝置，使高效液相色譜從進(jìn)樣、分離、檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理，一直到結(jié)果打印完全自動(dòng)化。
高效液相色譜法是在氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，與氣相色譜法相比較，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
1.應(yīng)用范圍廣 高效液相色譜法與氣相色譜法相比，具有應(yīng)用范圍更廣的優(yōu)點(diǎn)。它可用于高沸點(diǎn)、相對(duì)分子量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物以及各種離子的分離分析。只要把樣品制成溶液便可進(jìn)行分析，特別是一些生物大分子，如多肽、蛋白質(zhì)、生物堿、核酸、甾體、脂類、維生素等，都可用高效液相色譜法進(jìn)行分析。
2.選擇性高 氣相色譜法采用的流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒有親和力，即流動(dòng)相和組分不發(fā)生相互作用，僅起載帶作用。高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，對(duì)組分有不同的親和力，參與對(duì)組分的分配作用。流動(dòng)相對(duì)分離效果影響很大，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大的方便。因此，它不僅可以利用被分離組分的極性、分子尺寸、離子交換能力以及生物分子間親和力的差別進(jìn)行分離，還可通過改變流動(dòng)相的組成來改善分離效果，使得性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)分離的可能性比氣相色譜法更大。
3.氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行，且對(duì)控溫要求比較高，而高效液相色譜則經(jīng)常在室溫條件下進(jìn)行，且對(duì)控溫的要求也不高。
4.高效液相色譜法的餾分易于收集，更有利于制備。
高效液相色譜的主要缺點(diǎn)是：儀器比較昂貴；缺乏通用的高靈敏度檢測(cè)器；分析周期較長(zhǎng)；柱和流動(dòng)相的消耗成本高；有機(jī)溶劑會(huì)造成環(huán)境污染，危害操作人員的健康。
二、高效液相色譜法的分類
高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法的分類相同。
按固定相的物理狀態(tài)可分為液-液色譜法和液-固色譜法兩大類。
按分離原理可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、親和色譜法、化學(xué)鍵合相色譜法以及膠束色譜法（micelle chromatography，MC)等。
近年來，高效液相色譜法發(fā)展迅猛，許多新方法不斷涌現(xiàn)，又出現(xiàn)了一些其它的分類方法。如根據(jù)固定相和流動(dòng)相相對(duì)極性的大小，液液分配色譜法又可分為正相液液分配色譜法（normal-phase liquid-liquidpartition chromatography，NLLC)和反相液液分配色譜法（reversed-phase liquid-liquid partition chromatography，RLLC)，而后者又可進(jìn)一步分為普通反相液液分配色譜法、離子對(duì)色譜法（ion pair chromatography，IPC)和離子抑制色譜法（ion suppression chromatography，ISC)。
第二節(jié) 高效液相色譜儀
高效液相色譜儀主要由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等五部分組成。高檔的高效液相色譜儀還配有梯度洗脫、柱溫箱及自動(dòng)進(jìn)樣器等輔助裝置。高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖如圖10-1所示。
圖10-1 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖
高效液相色譜儀的工作流程如下：貯液器中的流動(dòng)相在高壓泵作用下經(jīng)由進(jìn)樣器進(jìn)入色譜柱，然后從檢測(cè)器流出。待分離試樣由進(jìn)樣器注入，流過進(jìn)樣器的流動(dòng)相將試樣帶入色譜柱中進(jìn)行分離，分離后的各組分依次進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器將被分離組分濃度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，進(jìn)而由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)將數(shù)據(jù)采集、記錄下來，得到色譜圖。
一、高壓輸液系統(tǒng)
高壓輸液系統(tǒng)一般由貯液器、脫氣裝置、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻尼器以及梯度洗脫裝置等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。
1.貯液器 貯液器用來貯存流動(dòng)相，其材料對(duì)流動(dòng)相是化學(xué)惰性的。常用的材料為玻璃、不銹鋼或表面涂聚四氟乙烯的不銹鋼等。為防止長(zhǎng)霉，貯液器中的流動(dòng)相要經(jīng)常更換，并經(jīng)常清洗貯液器。
2. 過濾和脫氣裝置 流動(dòng)相和樣品溶液的過濾非常重要，以免其中的細(xì)小顆粒堵塞色譜柱、毛細(xì)管以及影響高壓輸液泵的正常工作。流動(dòng)相在使用前應(yīng)根據(jù)其性質(zhì)選用不同材料的濾膜過濾，一般選用市售的0.45mm的水性和油性濾膜進(jìn)行過濾，水用水性濾膜過濾，甲醇等有機(jī)溶劑用油性濾膜過濾。樣品溶液一般用市售的0.45mm針形濾器過濾。另外，在流動(dòng)相入口、泵前、泵和色譜柱間都配置有各種各樣的濾柱和濾板。
流動(dòng)相進(jìn)入高壓泵前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2)，防止流動(dòng)相由色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。如果使用熒光檢測(cè)器，溶解氧還可能造成熒光猝滅。
常用的脫氣方法有：
（1)低壓脫氣法：低壓脫氣法又稱真空脫氣法，即通過抽真空除去溶液中的氣體。減壓過濾，也具有除去部分氣體的作用。但由于抽真空會(huì)導(dǎo)致溶劑的蒸發(fā)，對(duì)二元或多元流動(dòng)相的組成會(huì)有影響。
（2)吹氦脫氣法：氦在大多數(shù)溶劑中的溶解度極低，因此用氦氣鼓泡來除去流動(dòng)相中溶解的氣體。該法使用方便、脫氣效果好，但氦氣較貴。
（3)超聲波脫氣法：將貯液器置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)，超聲脫氣。此法操作簡(jiǎn)便，為大多數(shù)用戶采用，但脫氣效果不理想（脫氣效率約30%)。
（4)在線脫氣：目前，許多高檔的高效液相色譜儀都配備了在線脫氣裝置。在線脫氣裝置可以連續(xù)不斷地從流動(dòng)相中除去溶解的氣體，消除流動(dòng)相的不穩(wěn)定因素、降低基線漂移及噪音，從而消除了氧對(duì)電化學(xué)、熒光和紫外檢測(cè)的干擾。這種脫氣方法，效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。
3. 高壓輸液泵 高壓輸液泵（high pressure pump)的作用是提供足夠恒定的高壓，使流動(dòng)相以穩(wěn)定的流量快速通過固定相。一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合下列要求：① 密封性好，耐腐蝕；② 有足夠的輸出壓力，使流動(dòng)相能順利通過色譜柱；③ 輸出壓力平穩(wěn)，脈沖��；④ 輸出流量恒定，可調(diào)范圍寬；⑤ 泵室體積小（＜0.5 ml)，易于清洗，便于迅速更換溶劑。
高壓輸液泵按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩種。按工作方式又可分為隔膜泵、氣動(dòng)放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵。其中，隔膜泵和氣動(dòng)放大泵為恒壓泵，螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵為恒流泵。恒壓泵的特點(diǎn)是：在操作過程中保持輸出壓力恒定，但其流量隨色譜系統(tǒng)阻力變化而變化。恒流泵的特點(diǎn)是：在一定的操作條件下，輸出的流量保持恒定，不受色譜柱阻力和流動(dòng)相黏度等變化的影響。目前高效液相色譜儀廣泛采用的是柱塞往復(fù)泵，其結(jié)構(gòu)如圖10-2所示。這種泵的泵室體積小，一般只有幾毫升，易于清洗和更換溶劑，適合于梯度洗脫操作。缺點(diǎn)是輸出液流脈動(dòng)大，需要外加脈動(dòng)阻尼器。
圖10-2 柱塞往復(fù)泵示意圖
4.梯度洗脫裝置 梯度洗脫（gradient elution)是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定的時(shí)間程序連續(xù)或階段地改變?nèi)軇┑谋壤瑥亩淖兞鲃?dòng)相的極性、離子強(qiáng)度或pH值等，改善分離效果的一種方法。梯度洗脫對(duì)分離組分復(fù)雜、容量因子k范圍很寬的樣品非常重要。高效液相色譜法中的梯度洗脫與氣相色譜法中的程序升溫非常類似，兩者都是為了使樣品的各種組分均在最佳容量因子值范圍內(nèi)流出色譜柱，從而達(dá)到改善峰形、縮短分析時(shí)間和提高分離效果的目的。在等溫或等度洗脫（isocratic elution)情況下，或者由于保留時(shí)間過短而造成色譜峰擁擠、重疊，或者由于保留時(shí)間過長(zhǎng)而造成色譜峰扁平、寬大，分離效果不好；而在程序升溫或梯度洗脫情況下，各組分均能達(dá)到良好分離。
梯度洗脫裝置一般都采用微型計(jì)算機(jī)控制，可分為如下兩類。
（1)高壓梯度洗脫裝置：高壓梯度又稱內(nèi)梯度。采用的是先加壓后混合的方式，即用幾臺(tái)高壓泵將不同的溶劑，按程序規(guī)定的流量比輸入混合室，再使之進(jìn)入色譜柱。其特點(diǎn)是流量精度高、洗脫曲線重復(fù)性好、輸液系統(tǒng)中不易產(chǎn)生氣泡。
（2)低壓梯度洗脫裝置：低壓梯度又稱外梯度或泵前混合。早期的低壓梯度裝置是常壓下在容器中將溶劑按不同的比例混合，然后再由高壓泵輸入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，比例準(zhǔn)確，價(jià)格便宜；缺點(diǎn)是更換流動(dòng)相比例不方便，溶劑消耗量大，自動(dòng)化程度不高。目前許多儀器所用的低壓梯度洗脫裝置是四元梯度泵，該裝置可進(jìn)行二元、三元、四元梯度，電磁閥的開關(guān)頻率由控制器控制，改變控制程序即可得到任意組成的流動(dòng)相。該裝置洗脫重現(xiàn)性好，精度高，儀器組合簡(jiǎn)單，一個(gè)泵即可進(jìn)行梯度洗脫，但溶劑在混合前必須高度脫氣。一般采用四元梯度泵的儀器都配有自動(dòng)脫氣系統(tǒng)。
二、進(jìn)樣系統(tǒng)
進(jìn)樣系統(tǒng)是將樣品溶液導(dǎo)入色譜柱的裝置。在高效液相色譜法中，對(duì)進(jìn)樣裝置的要求是具有良好的密封性和重復(fù)性，死體積小。常用的進(jìn)樣方式有注射器進(jìn)樣和六通閥進(jìn)樣兩種。前者與氣相色譜法類似，進(jìn)樣時(shí)用微量注射器刺穿進(jìn)樣器的彈性隔膜將樣品注入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是裝置簡(jiǎn)單、價(jià)廉、死體積小。缺點(diǎn)是隔膜的穿刺部分在高壓情況下容易漏液，而且進(jìn)樣量有限，重現(xiàn)性差，有時(shí)需停泵進(jìn)樣。目前普遍采用是六通閥進(jìn)樣，如圖10-3所示。
圖10-3 六通閥進(jìn)樣示意圖
在“裝樣”位置，用注射器將試樣注入到六通閥的樣品定量管中，此時(shí)流動(dòng)相不通過樣品管。然后轉(zhuǎn)動(dòng)六通閥手柄至“進(jìn)樣”位置，試樣即隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱中。此法的優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)樣時(shí)可保持系統(tǒng)的高壓，進(jìn)樣方式簡(jiǎn)便、易操作，而且由于進(jìn)樣量可由定量管的體積嚴(yán)格控制，進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，自動(dòng)化程度高，適于作定量分析。
目前，許多高效液相色譜儀配有自動(dòng)進(jìn)樣裝置。自動(dòng)進(jìn)樣裝置是由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制進(jìn)樣閥，取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動(dòng)全部按預(yù)定的程序自動(dòng)進(jìn)行。自動(dòng)進(jìn)樣重現(xiàn)性好，適合大量樣品分析，節(jié)省人力，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。目前比較典型的自動(dòng)進(jìn)樣裝置有圓盤式和鏈?zhǔn)絻煞N。
三、分離系統(tǒng)
分離系統(tǒng)包括色譜柱、柱溫箱及連接管等。
色譜柱是高效液相色譜儀的心臟部件，高性能的色譜柱是建立穩(wěn)定、重現(xiàn)分析方法的根本。高性能的色譜柱與固定相本身的性能、柱結(jié)構(gòu)、裝填和使用技術(shù)等有關(guān)。色譜柱由柱管和固定相組成。色譜柱分為分析型和制備型兩類。分析型色譜柱長(zhǎng)10～25 cm，內(nèi)徑4～5 mm，制備型色譜柱長(zhǎng)10～30 cm，內(nèi)徑20～40 mm。
操作技術(shù)對(duì)柱效以及柱的壽命影響非常大，使用時(shí)必須注意：樣品最好用針形濾器過濾，或盡可能通過萃取或吸附等手段除去雜質(zhì)；流動(dòng)相的pH值應(yīng)控制在色譜柱所允許的范圍內(nèi)，一般為3～8之間；更換流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)根據(jù)流動(dòng)相的性質(zhì)選擇合適的溶劑沖洗儀器及色譜柱，防止流動(dòng)相相互不溶，使鹽析出，堵塞柱子；實(shí)驗(yàn)完畢，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)娜軇_洗柱子，尤其是流動(dòng)相含有鹽時(shí)，應(yīng)先用水沖洗，再用有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈)沖洗。
為了保持色譜柱的性能，通常在分析柱前要使用一個(gè)短的保護(hù)柱（又稱預(yù)柱)。一般保護(hù)柱內(nèi)的填料與分析柱中的固定相一致，這樣不僅可以將樣品和流動(dòng)相中的有害污染物保留，以延長(zhǎng)柱子的壽命，而且在液-液色譜中，還可以使洗脫液在經(jīng)過保護(hù)柱時(shí)就被固定相飽和，使分析柱內(nèi)不產(chǎn)生固定液流失。
高效液相色譜分析通常在室溫下進(jìn)行，但由于柱溫對(duì)組分的保留值有一定影響，所以高檔的儀器一般都配有柱溫箱，以保證分析時(shí)溫度恒定。
四、檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)系統(tǒng)的關(guān)鍵部件是檢測(cè)器。檢測(cè)器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)變?yōu)榭晒z測(cè)的信號(hào)。高效液相色譜儀的檢測(cè)器種類很多，按其應(yīng)用范圍可分為通用型和專用型（選擇性)兩大類。
通用型檢測(cè)器，又稱總體性質(zhì)檢測(cè)器（bulk property detector)，其響應(yīng)值取決于流出物（包括試樣和流動(dòng)相)總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)的變化。屬于這類檢測(cè)器的有示差折光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器。這類檢測(cè)器測(cè)量的是任何液體都共有的物理量，所以應(yīng)用范圍廣。但是由于它對(duì)流動(dòng)相本身有響應(yīng)，因此容易受溫度變化、流量波動(dòng)以及流動(dòng)相組成等因素的影響，造成較大的噪聲和漂移，靈敏度較低，不適于痕量分析，并且不能用于梯度洗脫。
專用型檢測(cè)器，又稱溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器（solute property detector)，其響應(yīng)值取決于流動(dòng)相中被分離組分的物理或物理化學(xué)性質(zhì)。屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)檢測(cè)器等。因?yàn)檫@類檢測(cè)器僅對(duì)某些被測(cè)物質(zhì)響應(yīng)靈敏，而對(duì)流動(dòng)相本身沒有響應(yīng)或響應(yīng)很小，所以靈敏度高，受外界影響小，并且可用于梯度洗脫。
（一)紫外-可見檢測(cè)器
紫外執(zhí)業(yè)獸醫(yī)-可見檢測(cè)器（ultraviolet-visibledetector，UVD或UV)是高效液相色譜儀應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，是一種選擇性檢測(cè)器，其特點(diǎn)是靈敏度高，噪聲低，線性范圍寬，基線穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，對(duì)流量和溫度變化不敏感，適用于梯度洗脫，不破壞樣品，能與其它檢測(cè)器串聯(lián)。
紫外-可見檢測(cè)器的工作原理和結(jié)構(gòu)與一般的紫外-可見分光光度計(jì)一樣，所不同是將樣品池改為體積很�。�5～12 µl)的流通池，以對(duì)色譜流出樣品進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。
紫外-可見檢測(cè)器可分為固定波長(zhǎng)型和可調(diào)波長(zhǎng)型兩類。固定波長(zhǎng)型檢測(cè)器因使用受到限制，已基本被淘汰；可調(diào)波長(zhǎng)型紫外-可見檢測(cè)器是以鎢燈和氘燈作為光源，檢測(cè)波長(zhǎng)從190～800 nm連續(xù)可調(diào)，樣品可以選擇在最大吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。因此，該類檢測(cè)器應(yīng)用廣泛。需要注意的是檢測(cè)器的工作波長(zhǎng)不能小于所使用流動(dòng)相溶劑的截止波長(zhǎng)。
二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD)是最有發(fā)展前途的高效液相色譜檢測(cè)器，屬于多波長(zhǎng)快速掃描紫外-可見檢測(cè)器。它采用光電二極管陣列作為檢測(cè)元件，構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接收器上的全部波長(zhǎng)的光信號(hào)，然后對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，獲得定性定量色譜-光譜信息，主要特點(diǎn)為：在一次進(jìn)樣后，可同時(shí)采集不同波長(zhǎng)下的色譜圖，因此可以計(jì)算不同波長(zhǎng)的相對(duì)吸收比；可提供每一色譜峰的UV-Vis光譜，因而有利于選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，用于最終建立高效液相色譜分析方法；檢查色譜峰各個(gè)位置的光譜，可以評(píng)價(jià)色譜峰純度。如果色譜峰為單一成分，色譜峰各點(diǎn)的光譜應(yīng)重疊；在色譜運(yùn)行期間可以逐點(diǎn)進(jìn)行光譜掃描，得到以時(shí)間-波長(zhǎng)-吸光度為坐標(biāo)的色譜-光譜三維圖（圖10-4)，由于每個(gè)組分都有全波段的吸收光譜圖，因此，可利用色譜保留值規(guī)律及吸收光譜綜合進(jìn)行定性分析。
（二)熒光檢測(cè)器
圖10-4 色譜-光譜三維圖
熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)D)的檢測(cè)原理及儀器結(jié)構(gòu)與熒光分光光度計(jì)相同，可對(duì)具有熒光特性的樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。熒光檢測(cè)器的特點(diǎn)是：靈敏度更高，比紫外-可見檢測(cè)器高1～3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限可達(dá)10-12～10-13 g/ml，是痕量分析的理想檢測(cè)器；對(duì)溫度和流動(dòng)相流速的變化不敏感；可以進(jìn)行梯度洗脫。
熒光檢測(cè)器不如紫外-可見檢測(cè)器應(yīng)用廣泛，主要原因是能產(chǎn)生熒光的化合物不多。但是，生物領(lǐng)域中的許多物質(zhì)，如氨基酸、胺類、維生素、甾類化合物、某些藥物、代謝物等具有熒光，可用熒光檢測(cè)。盡管有些化合物本身沒有熒光，但可通過衍生化反應(yīng)生成熒光衍生物進(jìn)行測(cè)定。
熒光檢測(cè)器同可調(diào)波長(zhǎng)紫外-可見檢測(cè)器一樣，也有多通道檢測(cè)器，具有程序控制多波長(zhǎng)檢測(cè)、自動(dòng)掃描功能。光導(dǎo)攝像管和光電二極管陣列檢測(cè)器也應(yīng)用于熒光檢測(cè)器，通過計(jì)算機(jī)處理，可獲得熒光強(qiáng)度-發(fā)射波長(zhǎng)-時(shí)間的三維色譜-熒光光譜圖。
新型的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（laser induced fluorescencedetector，LIF)已用于超痕量生物活性物質(zhì)和環(huán)境有機(jī)污染物的檢測(cè)，靈敏度可達(dá)10-9～10-12 mol/L。
（三)示差折光檢測(cè)器
示差折光檢測(cè)器（differential refractive indexdetector，DRID)是一種通用型檢測(cè)器，它是利用純流動(dòng)相和含有被測(cè)組分的流動(dòng)相之間折光率的差別進(jìn)行檢測(cè)的。幾乎所有物質(zhì)對(duì)光都有各自不同的折射率，因此，這種檢測(cè)器可檢測(cè)一定濃度的所有化合物。但是，由于DRID需嚴(yán)格控制溫度，流動(dòng)相中溶解的氣體對(duì)信號(hào)有影響，靈敏度不高，不能用于梯度洗脫等原因，限制了它的使用。
（四)電化學(xué)檢測(cè)器
電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemical detector，ECD)種類較多，有電導(dǎo)、庫侖、伏安、安培等檢測(cè)器。最常用的是安培檢測(cè)器和電導(dǎo)檢測(cè)器。安培檢測(cè)器是在一定外加電壓下，利用被測(cè)物質(zhì)在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化進(jìn)行檢測(cè)，它是一種選擇性檢測(cè)器。而電導(dǎo)檢測(cè)器是基于物質(zhì)在介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化進(jìn)行檢測(cè)。
ECD具有與熒光檢測(cè)器同樣的優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度和高選擇性。缺點(diǎn)是：要求高純度溶劑，流動(dòng)相具有導(dǎo)電性，對(duì)流速、溫度、離子強(qiáng)度、pH值等敏感，電極表面可能發(fā)生吸附、催化等，影響電極的性能和壽命。
近年來，多通道EC陣列檢測(cè)器已面世，色譜流出峰的電位-電流數(shù)據(jù)可在很短的時(shí)間窗中產(chǎn)生。與DAD提供的化合物的光譜相似，EC陣列檢測(cè)器可提供化合物的電化學(xué)曲線，用于化合物鑒別和純度測(cè)定。
（五)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器
化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器（chemiluminescence detector，CLD)是一種高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)器。其原理是基于某些物質(zhì)在常溫下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)的反應(yīng)中間體或反應(yīng)產(chǎn)物，當(dāng)它們從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，能量以光的形式釋放。由于物質(zhì)激發(fā)所需的能量來自化學(xué)反應(yīng)，所以叫做化學(xué)發(fā)光。當(dāng)被測(cè)組分從色譜柱流出后，立即與化學(xué)發(fā)光試劑混合，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體或產(chǎn)物，進(jìn)而產(chǎn)生輻射，其輻射強(qiáng)度與被測(cè)組分的濃度成正比。這種檢測(cè)器不需要光源，也不需要復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，只要一個(gè)恒流泵將化學(xué)發(fā)光試劑以一定的流速泵入混合器中，使之與柱流出物迅速而均勻地混合發(fā)生化學(xué)發(fā)光，再通過光電轉(zhuǎn)換裝置將光信號(hào)變成電信號(hào)，即可進(jìn)行檢測(cè)。
化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器均是發(fā)光檢測(cè)器，不同的是前者是由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)中間體或產(chǎn)物，不需要激發(fā)光源�；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)器的靈敏度較熒光檢測(cè)器的靈敏度更高，主要用于痕量分析。缺點(diǎn)是系統(tǒng)的復(fù)雜性及耐用性不佳，流動(dòng)相和反應(yīng)介質(zhì)的要求常有矛盾，使色譜方法的建立復(fù)雜化。
（六)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD)是一種通用型檢測(cè)器，對(duì)任何組分響應(yīng)無歧視。其工作原理是經(jīng)色譜柱分離的組分隨流動(dòng)相進(jìn)入霧化室，被高速氣流（氦、氮或空氣)霧化，然后進(jìn)入蒸發(fā)室，在蒸發(fā)室中流動(dòng)相被蒸發(fā)除去，不揮發(fā)的待測(cè)組分在蒸發(fā)室內(nèi)形成氣溶膠，然后進(jìn)入檢測(cè)室。用一定強(qiáng)度的入射光（白熾燈、鹵鎢燈或激光光源)照射氣溶膠而產(chǎn)生光散射，測(cè)定散射光，其強(qiáng)度與待測(cè)成分的濃度有關(guān)。
理論上，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可用于測(cè)定揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分，但由于它對(duì)有紫外吸收的樣品組分檢測(cè)靈敏度較低，且不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相，因而主要用于測(cè)定糖、高分子化合物、高級(jí)脂肪酸、糖苷等幾十類化合物。
五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
早期，高效液相色譜是通過記錄儀繪制譜圖，人工計(jì)算峰高或峰面積獲得分析結(jié)果的，十分麻煩。后來，有了積分儀，可以自動(dòng)打印峰高、峰面積、保留時(shí)間以及進(jìn)行一些簡(jiǎn)單的計(jì)算，但不能進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖譜的貯存及再處理�，F(xiàn)在廣泛使用色譜工作站記錄和處理色譜分析數(shù)據(jù)。工作站的功能非常強(qiáng)大，主要包括如下內(nèi)容：
1. 自診斷功能 工作站程序可以自動(dòng)智能診斷硬件。
2. 智能控制功能 流動(dòng)相流量、梯度洗脫程序、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相剩余體積等操作參數(shù)的設(shè)定，泵和檢測(cè)器等的開、關(guān)都可以通過工作站實(shí)現(xiàn)。
3. 數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)采集和圖譜處理功能 所有的色譜工作站都有這種功能。分在線和離線兩種方式。在線方式包括數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)采集、色譜圖的繪制、數(shù)據(jù)處理及分析結(jié)果輸出等；離線方式主要是數(shù)據(jù)和圖譜的再處理。利用數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)采集功能可以獲得色譜圖、各個(gè)色譜峰的參數(shù)以及根據(jù)色譜峰的參數(shù)計(jì)算出的柱效、分離度、Kovats保留指數(shù)、拖尾因子等；利用圖譜處理功能對(duì)圖譜進(jìn)行放大、縮小、峰形處理、多譜圖比較等。還可以按歸一化、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法等進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)可與Microsoft Excel、Word等軟件共享，譜圖可與Photoshop、CorelDraw等圖像軟件共享。
4. 進(jìn)行計(jì)量認(rèn)證的功能 工作站貯存有對(duì)色譜儀性能進(jìn)行計(jì)量認(rèn)證的專用程序，可對(duì)流動(dòng)相流量精度、檢測(cè)波長(zhǎng)校正等進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并可判定是否符合計(jì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)。
5. 多臺(tái)儀器控制功能 有些工作站可控制多套高效液相色譜系統(tǒng)，從方法的設(shè)定、運(yùn)行到結(jié)果輸出全部由工作站完成，并可連接局域網(wǎng)或互連網(wǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸及儀器遠(yuǎn)程診斷。
色譜數(shù)據(jù)工作站的出現(xiàn)不僅大大提高了色譜分析工作的速度，同時(shí)也為色譜分析的理論研究、新分析方法的建立創(chuàng)造了有利條件。
第三節(jié) 影響色譜峰展寬的因素及分離條件的選擇
一、影響色譜峰展寬的因素
在高效液相色譜中影響色譜峰展寬的因素，可歸納為柱內(nèi)因素和柱外因素兩類，下面分別予以介紹。
（一)影響柱內(nèi)展寬的因素
高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)方法而發(fā)展起來的一種分離分析方法。因此，色譜分析法概論和氣相色譜法中介紹的基本概念和基本理論，如保留值、分配系數(shù)、分離度、塔板理論、速率理論以及定性定量方法等同樣適用于高效液相色譜法。但是由于氣相色譜與高效液相色譜兩種方法的流動(dòng)相不同，因而在研究分離過程中各動(dòng)力學(xué)因素對(duì)色譜峰展寬（或柱效)的影響時(shí)，必須考慮氣體和液體之間在黏度、擴(kuò)散系數(shù)等方面的差異。Giddings和Snyder等人在Van Deemeter方程的基礎(chǔ)上，根據(jù)液體和氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程，即Giddings方程式
（10-1)
式中，He為渦流擴(kuò)散項(xiàng)，同Van Deemeter方程中的A項(xiàng)；Hd為縱向擴(kuò)散項(xiàng)，同Van Deemeter方程中的B/
1. 渦流擴(kuò)散項(xiàng) 該項(xiàng)含義與氣相色譜相同。由于高效液相色譜采用了比氣相色譜粒度更小、更均勻的球形固定相，故渦流擴(kuò)散項(xiàng)很小。
2. 縱向擴(kuò)散項(xiàng) 縱向擴(kuò)散項(xiàng)是由于組分分子在柱內(nèi)存在濃度梯度而引起的。
（10-2)
式中，Dm為被分離組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。Dm 與流動(dòng)相的粘度（h)成反比，與溫度成正比。由于流動(dòng)相為液體，其黏度比氣體大得多，柱溫又比氣相色譜低得多（HPLC多采用室溫)，因此，組分分子在液相中的Dm比其在氣相中的Dm小4～5個(gè)數(shù)量級(jí)，而高效液相色譜中流動(dòng)相的流速u又比較高，所以縱向擴(kuò)散項(xiàng)在高效液相色譜中很小，它對(duì)柱效的影響可以忽略不計(jì)。
3. 傳質(zhì)阻力項(xiàng) 傳質(zhì)阻力（mass transfer resistance)是由于組分在兩相間的傳質(zhì)過程不能瞬間達(dá)到平衡而引起的。與氣相色譜不同，在高效液相色譜中傳質(zhì)阻力包括固定相傳質(zhì)阻力（Hs)、動(dòng)態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（Hm)和靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（Hsmu)三項(xiàng)。
（1)固定相傳質(zhì)阻力：主要發(fā)生在分配色譜中，與氣液色譜中液相傳質(zhì)阻力相同。由于進(jìn)入固定液中的分子相對(duì)于未進(jìn)入固定液的分子在流動(dòng)相中滯后所致。Hs取決于固定液液膜的厚度df和組分分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)Ds，即
�。�10-3)
式中，Cs為與容量因子k 有關(guān)的常數(shù)。
在填充氣相色譜柱中，固定液的傳質(zhì)阻力起決定作用。而在高效液相色譜中，只有在使用厚涂層、并具有深孔的固定相時(shí)，Hs才是主要的。由于在高效液相色譜中通常采用化學(xué)鍵合固定相，“固定液”只是鍵合在載體表面的單分子層。因此，固定液的傳質(zhì)阻力可以忽略。
（2)動(dòng)態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：當(dāng)流動(dòng)相攜帶試樣分子流經(jīng)色譜柱時(shí)，靠近固定相表面的流動(dòng)相流速緩慢，而流路中心的流動(dòng)相流速較快，使得處于流路邊緣的分子遷移速度比處于流路中心的分子慢，從而引起色譜峰52667788.cn/rencai/展寬，見圖10-5（a)。這種影響引起板高的變化與流動(dòng)相的平均線速度u、固定相粒度dp的平方成正比，與組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm成反比。
（10-4)
式中，Cm為一常數(shù)。
圖10-5 流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力示意圖
（a)動(dòng)態(tài)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力 （b)靜態(tài)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力
（3)靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力：由于固定相的多孔性，會(huì)使部分流動(dòng)相滯留在微孔內(nèi)靜止不動(dòng)。由于孔有一定的深度，且深度各不相同，當(dāng)組分分子進(jìn)入孔中的靜態(tài)流動(dòng)相時(shí)，組分分子擴(kuò)散到孔中的深淺各不相同，因此回到動(dòng)態(tài)流動(dòng)相的先后也不相同，從而引起色譜峰展寬，見圖10-5（b)。固定相的微孔越小越深，傳質(zhì)阻力就越大，對(duì)峰展寬的影響也就越大。這種影響在整個(gè)傳質(zhì)過程中起主要作用。
（10-5)
式中，Csm為一常數(shù)。
氣相色譜主要考慮固定相的傳質(zhì)阻力，而高效液相色譜則主要考慮流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力，尤其是靜態(tài)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力在整個(gè)傳質(zhì)過程中起主要作用。因此，改進(jìn)固定相的結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力是提高高效液相色譜柱效的關(guān)鍵。
綜上所述，對(duì)于高效液相色譜，由于Hd可以忽略不計(jì)，則式10-1為
（10-6)
或簡(jiǎn)化為：
�。�10-7)
測(cè)定不同流速下的板高，以板高H對(duì)流速u作圖，可得H-u曲線。比較GC和HPLC的H-u曲線（見圖10-6)，可見兩者有明顯的不同。盡管高效液相色譜的H-u曲線也有最佳流速，但因?yàn)槠涮停趯?shí)際的操作條件下很難達(dá)到，因此，高效液相色譜塔板高度和流動(dòng)相流速的關(guān)系就成為式10-7所表示的線性關(guān)系，即流速增大，板高增加，柱效降低。
圖10-6 GC和HPLC的H－u曲
（二)影響柱外展寬的因素
柱外展寬的原因很多，主要是由低劣的進(jìn)樣技術(shù)和組分在進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道、接頭和檢測(cè)池等柱外死體積內(nèi)的擴(kuò)散造成的。由于樣品分子在液體流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)很小，致使進(jìn)樣器、連接管道、接頭和檢測(cè)池等柱外死體積對(duì)色譜峰展寬的影響很大。為了降低柱外效應(yīng)對(duì)峰展寬的影響，必須盡量減小柱外死體積。如采用進(jìn)樣閥進(jìn)樣或?qū)⒃嚇又苯幼⑸涞街^的中心部位；各部位連接時(shí)使用“零死體積接頭”；整個(gè)色譜系統(tǒng)的連接管路盡可能短；盡可能提高檢測(cè)器和放大器的響應(yīng)速度。
二、分離條件的選擇
從高效液相色譜的Giddings方程式可以看出，為了減小柱內(nèi)展寬，提高柱效，必須選擇合適的分離操作條件，以實(shí)現(xiàn)最佳分離。
（一)固定相的選擇
1. 要求固定相粒度（dp)小、篩分范圍窄、填充均勻，以減小渦流擴(kuò)散和動(dòng)態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力。
2. 選用淺孔道的表面多孔型載體或粒度小的全多孔型載體，以減少靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力和固定相的傳質(zhì)阻力。
（二)流動(dòng)相的選擇
從式10-4和10-5可知，降低Cm和Csm，提高柱效，可從減小dp，增加Dm著手。大多數(shù)情況下使用的都是商品柱，對(duì)使用者來說主要考慮的是Dm的影響。因?yàn)?i>Dm與溫度成正比，與黏度成反比，所以采用低黏度的流動(dòng)相或增加柱溫都可增大Dm，提高柱效。但在用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的色譜中，增加柱溫會(huì)產(chǎn)生氣泡。因此，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。改善分離效能主要通過采用低黏度的流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)。例如，在高效液相色譜法中廣泛使用甲醇作流動(dòng)相，而不用乙醇，就是因?yàn)榧状嫉酿ざ戎挥幸掖嫉囊话氲木壒省?/p>
（三)流速的選擇
從圖10-6高效液相色譜的H-u曲線可知，流動(dòng)相的流速將直接影響柱效。降低流速，可提高柱效，但流速太小會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。所以在實(shí)際應(yīng)用中，要在滿足分離效率的前提下，適當(dāng)提高流速。
（四)柱溫的選擇
溫度對(duì)組分的保留值影響較大，對(duì)色譜柱的選擇性也有一定影響。因此溫度是一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，而且操作比較方便。高效液相色譜大多在室溫下進(jìn)行，對(duì)溫度不加控制，主要是因?yàn)樵缙诘膬x器沒有柱溫箱。實(shí)驗(yàn)中，色譜柱甚至進(jìn)樣器及檢測(cè)器恒溫有許多優(yōu)點(diǎn)。如方法建立時(shí)優(yōu)化溫度，在常規(guī)分析中保證保留時(shí)間的重現(xiàn)性，特別是分離分析有機(jī)弱酸或弱堿等可解離的樣品時(shí)，恒溫常�？傻玫捷^好的結(jié)果。此外，適當(dāng)提高色譜柱溫度，可降低流動(dòng)相的黏度，降低傳質(zhì)阻力，提高柱效。
第四節(jié) 高效液相色譜固定相與流動(dòng)相
一、固定相
色譜柱中的固定相（填料)是高效液相色譜法的重要組成部分，它直接關(guān)系到柱效與分離度。現(xiàn)將主要的固定相類型介紹如下。
（一)液-固吸附色譜固定相
液-固色譜固定相多數(shù)是有吸附活性的吸附劑。常用的有硅膠、氧化鋁、高分子多孔微球、分子篩、聚酰胺等。按其結(jié)構(gòu)可分為表面多孔型和全多孔微粒型兩類，如圖10-7。
圖10-7 表面多孔型和全多孔微粒型固定相示意圖
1．表面多孔型 表面多孔型，又稱薄殼型，是在實(shí)心玻璃微球表面涂一層很�。s1～2 mm)的多孔色譜材料（如硅膠、氧化鋁等)燒結(jié)制成的。由于固定相是球體、填充均勻、滲透性好、多孔層很薄、表面孔隙淺，因此傳質(zhì)速度快，柱效高。其主要缺點(diǎn)是比表面積小，柱容量低、允許進(jìn)樣量小，要求檢測(cè)器的靈敏度高。
2. 全多孔微粒型 全多孔微粒型有無定型或球型兩種，顆粒直徑3～10 mm。具有粒度小、比表面積大、孔隙淺、柱效高、容量大等優(yōu)點(diǎn)，特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。目前高效液相色譜法大多采用直徑3～5 mm的球型填料。
（二)液-液分配色譜固定相
液-液分配色譜的固定相是在載體上涂漬適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簶?gòu)成，載體可以是玻璃微球，也可以是吸附劑。早期是將固定液機(jī)械涂漬在載體上，這樣涂漬的固定液不僅易被流動(dòng)相逐漸溶解而流失，而且會(huì)導(dǎo)致色譜柱上保留行為的改變以及引起分離樣品的污染。為了解決固定液的流失問題，改善固定相的功能，產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相，簡(jiǎn)稱化學(xué)鍵合相。
化學(xué)鍵合相（chemical bonded phase)是利用化學(xué)反應(yīng)通過共價(jià)鍵將有機(jī)基團(tuán)結(jié)合到載體（硅膠)表面制成的。
化學(xué)鍵合固定相的優(yōu)點(diǎn)是：① 傳質(zhì)速度比一般液體固定相快，因此柱效高；② 固定液不流失，耐溶劑沖洗，色譜柱的穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)；③ 可以鍵合不同性質(zhì)的有機(jī)基團(tuán)，改善固定相的性能，進(jìn)一步改變分離選擇性；④ 適于作梯度洗脫。
化學(xué)鍵合相是高效液相色譜較為理想的固定相，在高效液相色譜分析中占有極重要的地位�；瘜W(xué)鍵合相按基團(tuán)與載體（硅膠)相結(jié)合的化學(xué)鍵類型，分為酯化型（Si—O—C)和硅烷化型（Si—O—Si—C)等。酯化型鍵合相具有良好的傳質(zhì)特性，但易水解、醇解，熱穩(wěn)定性差，已被淘汰。
硅烷化型是利用氯硅烷與硅醇基進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，生成具有Si—O—Si—C鍵的固定相。反應(yīng)如下：
這類鍵合相具有熱穩(wěn)定性好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下、pH3～8的范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用范圍廣泛。
化學(xué)鍵合相按鍵合基團(tuán)的性質(zhì)，可分為極性、中等極性和非極性三類。
1. 極性鍵合相 常用氨基、氰基鍵合相。分別將氨丙硅烷基[—Si(CH2)3NH2]和氰乙硅烷基[—SiCH2CH2CN]鍵合在硅膠表面制成。它們可用作正相色譜的固定相。氨基鍵合相是分析糖類最常用的固定相。
2. 中等極性鍵合相 常見的有醚基鍵合相。這種鍵合相既可作正相又可作反相色譜的固定相，視流動(dòng)相的性質(zhì)而定。
3. 非極性鍵合相 硅膠表面鍵合烴基硅烷，所得到的就是非極性鍵合相。非極性鍵合相通常用于反相色譜，亦稱為反相鍵合相。其烴基配基可以是不同鏈長(zhǎng)的正構(gòu)烷烴，如十八烷基硅烷（octadecylsilane，ODS或用C18表示)、辛烷基硅烷（用C8表示)，又可以是帶有苯基的碳鏈，如—(CH2)3C6H5，其中以含十八個(gè)碳原子的烷基硅烷鍵合相應(yīng)用最廣泛。
應(yīng)該說明的是，這里介紹的鍵合相是指用于正相和反相色譜的狹義化學(xué)鍵合相。廣義的鍵合相還應(yīng)包括鍵合型離子交換劑、手性固定相以及親合色譜等。
（三)離子交換色譜固定相
早期的離子交換色譜法是以離子交換樹脂作固定相，這種固定相遇溶劑易膨脹，不耐壓，傳質(zhì)速度慢，不適合高效液相色譜法，目前已被離子交換鍵合相代替。
離子交換鍵合相也是以薄殼型或全多孔微粒硅膠為載體，表面經(jīng)化學(xué)反應(yīng)鍵合上各種離子交換基團(tuán)。和離子交換樹脂一樣，離子交換鍵合相也可分為陽離子交換鍵合相和陰離子交換鍵合相。陽離子交換鍵合相又可分為強(qiáng)酸和弱酸型陽離子交換鍵合相，陰離子交換鍵合相又可分為強(qiáng)堿和弱堿型陰離子交換鍵合相。其中強(qiáng)酸型和強(qiáng)堿型離子交換鍵合相較穩(wěn)定，在高效液相色譜中應(yīng)用較多。
（四)尺寸排阻色譜固定相
尺寸排阻高效液相色譜法常用的固定相為具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠。根據(jù)耐壓程度可分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三類。
軟質(zhì)凝膠如葡聚糖凝膠等，具有較大的溶脹性，只適用于常壓下的尺寸排阻色譜法。半硬質(zhì)凝膠如苯乙烯和二乙烯苯的共聚物凝膠，能耐較高的壓力，適用于以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的色譜法。這種凝膠的特點(diǎn)是有一定可壓縮性，可填得緊密，柱效高。缺點(diǎn)是凝膠在有機(jī)溶劑中稍有溶脹，柱的填充狀態(tài)會(huì)隨流動(dòng)相改變。硬質(zhì)凝膠有多孔硅膠及多孔玻珠等，屬于無機(jī)凝膠。其優(yōu)點(diǎn)是在溶劑中不變形，孔徑尺寸固定，化學(xué)惰性，穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)是裝柱時(shí)易碎，不易裝緊，柱效較低；吸附性較強(qiáng)，有時(shí)易造成拖尾。
新型凝膠色譜填料也是以薄殼型或全多孔微粒硅膠為載體，表面經(jīng)化學(xué)反應(yīng)鍵合上各種類型軟質(zhì)凝膠制成。新型凝膠克服了軟質(zhì)凝膠的一些弱點(diǎn)，粒度細(xì)，機(jī)械強(qiáng)度高，分離速度快，分離效果好。特別是在無機(jī)載體表面鍵合親水性單糖或多糖型凝膠在生物大分子的分離方面有廣泛的應(yīng)用前景。
（五)親和色譜固定相
親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離的一種方法。親和色譜固定相通常是在載體表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯(lián)氨等)，然后再連接上生物專一性的配基（如酶、抗原或激素等)。這種配基只能保留與其具有親和力特性的生物大分子。當(dāng)含有親和物的復(fù)雜混合試樣隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，親和物與配基結(jié)合被保留，而與其它組分分離，見圖10-8。其它組分流出色譜柱后，再改變條件，降低親和物和配基的結(jié)合力，將保留在柱上的大分子以純品形式洗脫下來。
圖10-8親和色譜法分離示意圖
親和色譜法也可以認(rèn)為是一種選擇性過濾，它選擇性強(qiáng)，純化效率高，往往可以一步獲得純品，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)中各種酶、輔酶、激素、糖類、核酸和免疫球蛋白等的分離和純化。
（六)手性固定相
對(duì)映異構(gòu)體，除了光學(xué)性質(zhì)有所不同外，具有完全相同的理化性質(zhì)，使用通常的高效液相色譜技術(shù)很難分離。對(duì)映體的拆分曾被認(rèn)為是非常困難和繁雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，手性高效液相色譜法的發(fā)展，為解決這一難題找到了出路。手性高效液相色譜法分離對(duì)映體的方法有三種：手性固定相法、手性流動(dòng)相添加劑法和手性衍生化試劑法，其中手性固定相法由于具有直接、快速、高效、簡(jiǎn)便以及適用性廣等優(yōu)點(diǎn)而成為分離對(duì)映體的首選方法。
手性固定相法是利用鍵合在固定相上的手性識(shí)別劑與對(duì)映體反應(yīng)形成非對(duì)映復(fù)合物，然后進(jìn)行分離測(cè)定。
二、流動(dòng)相
高效液相色譜流動(dòng)相有兩個(gè)作用，一是攜帶樣品通過色譜柱；二是給被分離組分提供一個(gè)分配相，進(jìn)而調(diào)節(jié)選擇性，使混合物實(shí)現(xiàn)分離�？捎米鞲咝б合嗌V流動(dòng)相的溶劑很多，而且還可組成不同配比的多元溶劑系統(tǒng)，選擇余地很大。在固定相一定時(shí)，流動(dòng)相的種類、配比能嚴(yán)重影響分離效果。因此，在高效液相色譜法中，流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要。
（一)對(duì)流動(dòng)相的基本要求
1.對(duì)被分離的樣品有適宜的溶解度。最好使k值在1～10之間。k值太小，不利于分離；k值太大，可能使樣品在流動(dòng)相中沉淀。
2.與樣品及固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
3.黏度小，有利于提高傳質(zhì)速度，提高柱效，降低柱壓。
4.與檢測(cè)器匹配，如使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下不應(yīng)有吸收。
5.純度高。
（二)流動(dòng)相對(duì)分離度的影響
流動(dòng)相對(duì)分離度的影響，可用公式（10-8)說明。
（10-8)
在氣相色譜中，r21與k分別受固定相性質(zhì)和柱溫的影響，一般通過改變柱溫與選擇固定相來改善分離效果。而在高效液相色譜中，r21主要受流動(dòng)相性質(zhì)的影響，k主要受流動(dòng)相配比的影響。流動(dòng)相種類不同，分子間的相互作用力不同，有可能使被分離組分的分配系數(shù)不等。流動(dòng)相種類確定后，改變流動(dòng)相的配比，可改變流動(dòng)相的極性和洗脫能力。由此可見，流動(dòng)相的選擇是以能獲得較大的r21值和適宜的k值，即各組分彼此分離并且有適宜的保留時(shí)間tR為目的。
（三)流動(dòng)相的選擇
流動(dòng)相的選擇雖有一般的指導(dǎo)原則，但更多的是靠實(shí)際經(jīng)驗(yàn)。顯然，溶劑的極性（常用Snyder溶劑強(qiáng)度參數(shù)e0來衡量)是重要依據(jù)。對(duì)于正相分配色譜，一般先選用中等極性溶劑作為流動(dòng)相，若組分的保留時(shí)間太短，說明流動(dòng)相極性太大，需改用極性較弱的溶劑；若組分保留時(shí)間太長(zhǎng)，說明流動(dòng)相極性太小，需改用極性較強(qiáng)的溶劑。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)后，才能確定最適宜的流動(dòng)相溶劑。在反相色譜中，一般采用水為流動(dòng)相的主體，再加入不同配比的有機(jī)溶劑作調(diào)節(jié)劑。
實(shí)際工作中，除上述根據(jù)溶劑的強(qiáng)度參數(shù)選擇流動(dòng)相外，還往往通過加入流動(dòng)相添加劑來改善分離效果，如前述的在流動(dòng)相中添加手性識(shí)別劑以分離手性化合物。在高效液相色譜中，比較典型的例子是離子對(duì)色譜法和離子抑制色譜法。
離子對(duì)色譜法可分為正相離子對(duì)色譜法和反相離子對(duì)色譜法。實(shí)際應(yīng)用中主要是反相離子對(duì)色譜法，它是把離子對(duì)試劑加到流動(dòng)相中，使被分離組分（離子)在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑生成中性離子對(duì)，提高固定相對(duì)被分離組分的保留作用，改善分離效果。離子對(duì)色譜法是一種特殊的反相色譜分離技術(shù)，它兼有反相色譜和離子交換色譜共同的特點(diǎn)，分析速度快，分離效果好。主要適用于分離強(qiáng)電解質(zhì)和弱電解質(zhì)的混合物，或電解質(zhì)和非離解物質(zhì)的混合物。離子對(duì)色譜法的缺點(diǎn)是離子對(duì)試劑價(jià)格較貴。
離子抑制色譜法是通過向流動(dòng)相中加入少量弱酸、弱堿或緩沖鹽，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制組分的解離，提高固定相對(duì)組分的保留作用，改善峰型，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸和弱堿的目的。離子抑制色譜法通常用于反相色譜法中，影響組分的保留值的因素，除與反相液相色譜法相同外，還受流動(dòng)相pH值的影響。對(duì)于弱酸，如果流動(dòng)相的pH值小于它的pKa，其主要存在型體為弱酸分子，則k值增大；反之，如果流動(dòng)相的pH值大于它的pKa，其主要存在型體為酸根離子，則k值變小。對(duì)于弱堿，情況相反。離子抑制色譜法適用于分離pKa為3～7的弱酸、pKb為7～8的弱堿及兩性化合物。
第五節(jié) 高效液相色譜法的應(yīng)用
高效液相色譜法由于不受所分析樣品揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性的限制，其應(yīng)用范圍比氣相色譜廣泛得多，可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、食品分析、環(huán)境污染分析、生物化學(xué)、藥物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域。
一、在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用
生命科學(xué)是二十一世紀(jì)自然科學(xué)研究中極為重要的前沿課題，高效液相色譜法是生命科學(xué)研究的重要手段之一。HPLC不僅可以對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)、核糖核酸、維生素、酶等生物分子進(jìn)行分離、純化和測(cè)定，而且可以通過測(cè)定結(jié)果揭示生命過程。高效液相色譜法在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要有兩方面：① 分離和檢測(cè)：主要針對(duì)一些小的分子，如氨基酸、有機(jī)酸、有機(jī)胺、類固醇、卟啉、嘌呤以及維生素等；② 分離、提純和測(cè)定：主要針對(duì)一些生物大分子，如多肽、蛋白質(zhì)、核糖核酸以及酶等。此外，在臨床診斷和重大疾病預(yù)警方面，高效液相色譜也有廣泛的應(yīng)用前景。
二、在食品分析中的應(yīng)用
食品質(zhì)量與安全是世界各國都極為關(guān)注的問題，食品分析是保障食品質(zhì)量安全的基礎(chǔ)。高效液相色譜法是食品分析的重要方法之一，能有效地檢測(cè)食品中有毒物質(zhì)和是否摻假。利用高效液相色譜法可測(cè)定食品中糖類、人工甜味劑、色素、防腐劑、有機(jī)酸、維生素、氨基酸、抗氧化劑等。如食品中維生素的測(cè)定，用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，不僅方法的靈敏度高、精密度好，而且能一次測(cè)定多種維生素，不論是脂溶性還是水溶性維生素都可得到滿意結(jié)果。
三、在環(huán)境分析中的應(yīng)用
人群健康與環(huán)境質(zhì)量密切相關(guān)，環(huán)境污染對(duì)健康的危害程度日益嚴(yán)重，已成為二十一世紀(jì)社會(huì)發(fā)展所面臨的十分重要的問題之一。應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定的環(huán)境污染物主要有多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、酚類、異腈酸酯類等化合物。
四、在藥物分析中的應(yīng)用
高效液相色譜法目前可認(rèn)為是在藥物分析領(lǐng)域中最活躍的一種分析方法，無論是原料藥、制劑、制藥原料及中間體、中藥及中成藥，還是藥物的代謝產(chǎn)物，高效液相色譜法都是分離、鑒定和含量測(cè)定的首選方法。
（毋福海)
