綜合性實(shí)驗(yàn)一 膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測
從臨床標(biāo)本中分離細(xì)菌的目的是為了查找與疾病有關(guān)的病原菌，這對(duì)于臨床治療及預(yù)后調(diào)查是很有價(jià)值的。所以，在分離時(shí)應(yīng)掌握以下原則，以便指導(dǎo)檢出病原菌，避免漏診誤診。
1．了解微生物在人體的分布。人體的很多部位與外界相通，存在正常菌群，分離時(shí)應(yīng)注意
標(biāo)本中的菌群是正常菌群的污染，還是致病菌。另外，機(jī)體的某些部位(如血液、骨髓)是
無菌的，如檢出細(xì)菌，應(yīng)視為致病菌。
2．了解標(biāo)本來源及臨床情況，以便有目的地檢出病原菌。
3．根據(jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌確定選用各種分離培養(yǎng)基，以提高檢出率。如血平板
常見的化膿性病原菌有葡萄球菌、鏈球菌、淋球菌、腦膜炎球菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核桿菌、
假單胞菌、流感桿菌等。膿汁標(biāo)本在做細(xì)菌分離培養(yǎng)的同時(shí)，均須直接涂片檢查，觀察是否有
典型形態(tài)的菌體，芽胞有無，為臨床提供最初的診治依據(jù)。
糞便標(biāo)本中常含有很多雜菌，應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康木牟煌x擇培養(yǎng)基(如SS、伊紅美藍(lán)平板，堿性蛋白胨水)，盡可能地抑制雜菌，以利于病原菌的檢出。糞便標(biāo)本中常見的病原菌有
志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌、弧菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。糞便標(biāo)
本中因各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辯是否為病原菌，因此，糞便標(biāo)本
一般不作直接涂片檢查，只有檢查霍亂弧菌、結(jié)核桿菌、疑似葡萄球菌或艱難梭菌引起的偽
膜性腸炎，以及菌群失調(diào)時(shí)，才作直接涂片檢查。
細(xì)菌鑒定工作的原則及基本方法是：
1、必須用純的細(xì)菌培養(yǎng)物作鑒定。因?yàn)椴煌募?xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果相差較大，而反應(yīng)結(jié)果是
以陽性或陰性表示的，一旦用混合菌做生化反應(yīng)，結(jié)果不可分析。
2、鑒定方法的選擇。測定細(xì)菌特征的實(shí)驗(yàn)方法很多，應(yīng)根據(jù)鑒定目的選擇有價(jià)值的、快速
簡便的試驗(yàn)項(xiàng)目，既能完成鑒定，試驗(yàn)項(xiàng)目又盡可能少。
一、 培 養(yǎng) 基 的 制 備
Preparation of Culture Media
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1了解細(xì)菌生長的基本營養(yǎng)條件。
2熟悉培養(yǎng)基的種類。
3掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
培養(yǎng)基是用人工方法將微生物生長繁殖所需要的多種營養(yǎng)物質(zhì)，按比例混合配制而成的營養(yǎng)
制品，其主要用途是分離培養(yǎng)純種微生物，傳代或保存微生物，鑒別微生物的種屬，研究微
生物的生理及生化特性，制造疫苗、微生態(tài)制劑或其他微生物制劑。
培養(yǎng)基基本成分包括：(1)營養(yǎng)物質(zhì)，如碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子等；(2)水份；(3)
凝固物質(zhì)，最常用的凝固劑為瓊脂；(4)抑制劑，如膽鹽、抗生素等，其目的是抑制非檢出
菌的生長或使其少生長，有利于檢出菌的生長。
培養(yǎng)基的種類很多，根據(jù)物理性狀，培養(yǎng)基可分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基三種，固體培
養(yǎng)基又有平板和斜面之分。根據(jù)用途，培養(yǎng)基可分為：
(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有一般細(xì)菌生長繁殖需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)
，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分。
(2)營養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)如血液、
血清或生長因子等，用以培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高的微生物。
(3)選擇性培養(yǎng)基利用微生物對(duì)某些化學(xué)物質(zhì)的敏感
性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，
抑制不需要的微生物生長，有利于所需分離的微生物生長，從而達(dá)到分離或鑒別某種微生物
的目的。
(4)鑒別培養(yǎng)基是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某
種微生物在這種培養(yǎng)基上
培養(yǎng)后，產(chǎn)生某種特定代謝產(chǎn)物，與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應(yīng)
。
培養(yǎng)基的制備原則：(1)適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分；(2)合適的酸堿度；(3)配制后經(jīng)滅菌手續(xù)使之無
菌，方可使用。將滅菌后的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，必須無細(xì)菌生長。
培養(yǎng)基制備程序可分為調(diào)配、溶化、矯正pH、分裝、滅菌、檢定及保存等步驟。制備好的培
養(yǎng)基，應(yīng)注明名稱、制作日期，存放在4℃冰箱中。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一肉湯培養(yǎng)基(meat infusion broth)的制備
供作一般細(xì)菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其成分為：
牛肉浸膏3g
蛋白胨10g
NaCl5g
蒸餾水1000ml
pH7.4～7.6
【材料】
天平稱量紙藥勺pH試紙(pH5.4～9)三角燒瓶量筒試管試管架5ml吸管吸
頭棉塞標(biāo)簽紙牛皮紙線繩
【方法】
1稱取一定量的肉湯培養(yǎng)基，置于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水。
2溶解后校正pH至7.4～7.6，分裝到三角燒瓶或試管中(裝量以試管高度的1/4左右為宜)。
多數(shù)生化試驗(yàn)用的鑒別培養(yǎng)基，可分裝于毛細(xì)玻璃管內(nèi)，加熱熔封，滅菌后備用。
3三角燒瓶和試管口塞上用普通棉花制作的棉塞(棉塞的形狀、大小和松緊要合適，才能起
到防止雜菌侵入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染和有利通氣的作用)，在棉塞外包一層牛皮紙，以防滅
菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。
4貼上標(biāo)簽，滅菌后使用。
二普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar)的制備
瓊脂是從海藻中提取的一種膠體多糖類物質(zhì)，一般不被細(xì)菌分解利用，故對(duì)細(xì)菌無營養(yǎng)作用
，其特點(diǎn)是能在100℃溶化、40℃以下凝固，因此，它是作為固體培養(yǎng)基賦形的理想凝固劑
。將不同量的瓊脂加入肉湯中趁熱可制成斜面、平板等不同類型的固體培養(yǎng)基(含瓊脂2～2.
5%)或半固體培養(yǎng)基(含瓊脂0.3～0.5%)，供分離、培養(yǎng)、傳代和保存細(xì)菌等使用。
【材料】
普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蒸餾水三角燒瓶平皿試管5ml吸管酒精燈
【方法】
1在上述配制的肉湯培養(yǎng)基中加入2－2.5%的瓊脂，或者稱取一定量的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置
于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水。
2滅菌后冷卻至50～60℃(以防止冷凝水太多)時(shí)，以無菌操作傾入已滅菌的平皿中制成平
板。若平皿內(nèi)徑為9cm，可傾注12～15ml；若內(nèi)徑為7cm的平皿，傾注10～12ml。輕輕搖動(dòng)平
皿底部，待凝固后即成。
3如果要制作斜面，滅菌前將培養(yǎng)基溶化、分裝到試管中(裝量不超過試管高度的1/5)，滅
菌后趁熱斜放，冷卻后即成斜面(斜面的長度不超過試管總長的1/2)。
4如果要制作半固體培養(yǎng)基，分裝量可為試管長度的1/4～1/3，滅菌后趁熱直立待凝。
三血平板(blood agar)的制備
適于各類細(xì)菌生長，鏈球菌、肺炎球菌等營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌必須要用血平板。一般細(xì)菌檢
驗(yàn)標(biāo)本的分離多應(yīng)接種血平板。在血平板上除了可以觀察菌落的形態(tài)外，還可判斷溶血情況
。
【方法】
1將已滅菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化。
2冷卻至50℃左右時(shí)，加入10%無菌脫纖維羊血(臨用前，應(yīng)置于37℃水浴預(yù)溫)，輕輕搖勻
。
3以無菌操作傾入滅菌的空培養(yǎng)皿中。
四、伊紅美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基的制備
分離腸道致病菌用，其成分為：
牛肉浸膏5g
蛋白胨10g
氯化鈉5g
瓊脂15g
乳糖10g
蒸餾水1000ml
無菌2%伊紅Y水溶液 20ml
無菌0.5%美藍(lán)水溶液20ml
pH7.2～7.4
注：
伊紅、美藍(lán)為指示劑，且有抑制革蘭氏陽性菌生長的作用。大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅
與美藍(lán)呈色，形成紫黑色菌落，且有金屬光澤；腸道致病菌不發(fā)酵乳糖，菌落呈粉紅色，有
時(shí)可因堿性物質(zhì)較多，細(xì)菌帶負(fù)電荷染上美藍(lán)而呈藍(lán)色菌落。
【方法】
1加熱溶化已滅菌的蛋白胨、肉湯瓊脂，溶化后立即趁熱加入已滅菌的乳糖。
2待冷卻至50～60℃時(shí)，加入已滅菌的伊紅及美藍(lán)水溶液，充分搖勻。
3以無菌操作傾注平皿。凝固后，冷藏備用。
【注意事項(xiàng)】
●攪拌或振蕩器皿或延長放置時(shí)間，以促進(jìn)干燥培養(yǎng)基的溶解。
●干燥培養(yǎng)基一般已校正pH。用時(shí)須再驗(yàn)證。通常培養(yǎng)基滅菌后pH約可降低0.1～0.2，在矯
正時(shí)應(yīng)比實(shí)際需要的pH提高0.1～0
.2。
●傾注培養(yǎng)基時(shí)，切勿將皿蓋全部啟開，以免空氣中塵埃及細(xì)菌落入。
●瓊脂平板放4℃冰箱保存，正面向下(倒置)，以防細(xì)菌落入而污染。
●新制成的平板培養(yǎng)基表面水分較多，不利于細(xì)菌的分離，可將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約
30分鐘，待平板表面干燥后使用。
【思考題】
①人工培養(yǎng)細(xì)菌需要提供的條件是什么?
②培養(yǎng)基制備的原則是什么?
③如何證明培養(yǎng)基滅菌是否徹底?
④怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格?
⑤培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途?
二、 消毒與滅菌
Disinfection And Sterilization
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1了解理化因素對(duì)細(xì)菌的影響。
2掌握常用的消毒滅菌法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
微生物廣泛存在于周圍環(huán)境，其中有些又是病原微生物，因此，從預(yù)防感染出發(fā)，醫(yī)務(wù)工作
者必須建立無菌觀念和嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，這就要求必須對(duì)所用的物品(如注射器、手術(shù)器
械、手術(shù)衣等)和工作環(huán)境(如無菌操作室、手術(shù)室、產(chǎn)房等)進(jìn)行滅菌或消毒，以確保所用
的物品和工作環(huán)境的無菌或處于無菌狀態(tài)；為防止疾病的傳播，對(duì)傳染病患者的排泄物和實(shí)
驗(yàn)廢棄的培養(yǎng)物亦須進(jìn)行滅菌或消毒處理。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一般都需要在無菌條件下進(jìn)行，為
此必須對(duì)培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)器材和試劑等進(jìn)行滅菌，并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。可見，消毒與滅菌是
微生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)必不可少的基本知識(shí)。
物理滅菌方法有干熱滅菌、濕熱滅菌、過濾滅菌等，可根據(jù)具體情況選用不同的滅
菌法。干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種�；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和
鑷子等，無菌操作時(shí)的試管口、瓶口也可在火焰上作短暫燒灼滅菌。
煮沸100℃經(jīng)5～10分鐘，可殺死細(xì)菌的繁殖體，但不能殺死細(xì)菌的芽胞。因此，煮沸法
主要用于一般外科手術(shù)器械、膠管和注射器等的消毒，亦可用于飲水和食具的消毒。
高壓蒸汽滅菌法是實(shí)驗(yàn)室中最常用最有效的方法。水在大氣壓中100℃左右沸騰，大氣壓增
加沸騰溫度將隨之增加。因此，在密閉的高壓滅菌器內(nèi)，當(dāng)蒸汽壓增加到1.05kg/cm2(15
磅)
時(shí)，溫度則達(dá)到121.3℃，在這種溫度下，15～30分鐘即可殺死所有微生物及細(xì)菌的芽胞。
凡能耐高熱和潮濕的物品如培養(yǎng)基、生理鹽水、紗布、手術(shù)器械、注射器、玻璃器材等都可
應(yīng)用高壓蒸汽滅菌法滅菌。
過濾除菌法適用于除去糖溶液、血清培養(yǎng)基、藥物等不耐熱液體中的細(xì)菌，所用設(shè)備為濾菌
器，由孔徑細(xì)小，能阻擋細(xì)菌通過的纖維素膜、陶瓷板、石棉板等制成。各種濾膜或?yàn)V板的
濾孔大小不同，可供選擇。
波長200～300nm之間的紫外線具有殺菌能力，尤以波長為260nm殺菌能力最強(qiáng)。紫外線通過
干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制而使細(xì)菌死亡。因紫外線穿透力不強(qiáng)，可被普通玻璃及紙片吸收，所以
常用于實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室、傳染病房等的空氣及物體表面的消毒。紫外線燈距照射物以不
超過1.2米為宜，照射20～30分鐘即可殺死空氣中的細(xì)菌。
化學(xué)消毒劑一般對(duì)病原微生物和機(jī)體都有毒性，因此只能用于物品、周圍環(huán)境以及人體體表
局部的消毒。消毒劑的作用原理：(1)使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，如含汞的重金屬鹽類、龍
膽紫、酒精、甲醛等；(2)破壞細(xì)菌的酶系統(tǒng)，如高錳酸鉀、雙氧水、碘液、漂白粉等
；(3)改變細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，如新潔爾滅、肥皂、來蘇兒等。
圖1手
提式高壓蒸汽滅菌器示意圖
1.螺栓2.銷子3.器身4.蓋子5.安全閥
6.提把7.壓力表8.螺母9.排氣閥10.排氣管
11.提柄12.密封墊圈13.內(nèi)桶14.篩片
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一高壓蒸汽滅菌法(autoclaving)
手提式高壓蒸汽滅菌器(見圖1)是一雙層筒狀金屬容器，兩層之間盛水，外筒堅(jiān)厚，上端有
蓋，蓋旁附有螺旋，使用時(shí)將螺旋扭緊，使蓋緊閉蒸汽不能外溢。蓋上裝有排氣閥門和安全
閥門，以調(diào)節(jié)器內(nèi)蒸汽壓力，壓力表表示內(nèi)部溫度和壓力。內(nèi)筒用于盛放欲滅菌的物品。
【方法】
1先向器內(nèi)加水，然后把要滅菌的物品裝入內(nèi)筒，將器蓋蓋好，擰緊螺旋。
2打開排氣閥門，加熱，待冷空氣完全排出后再關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。
3待器內(nèi)壓力上升到所需數(shù)值(一般為15磅)時(shí)，減少爐火，使壓力維持不變，約15～30分
鐘。
4關(guān)閉熱源，自然放涼，待壓力表指針下降到零后，打開排氣閥，開蓋取物。
【注意事項(xiàng)】
●滅菌時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行，切勿擅自離開，尤其是升壓和保壓期間要注意壓力表指
針的變化，避免壓力過高而導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被破壞，以及意外事故的發(fā)生。
●高壓蒸汽滅菌時(shí)，必須待器內(nèi)冷空氣完全排出后才可關(guān)閉排氣閥加壓，否則即使壓力達(dá)到
15磅，溫度也達(dá)不到121℃，不能達(dá)到滅菌效果。
●務(wù)必待壓力下降到零時(shí)，方可開蓋，否則會(huì)因器內(nèi)壓力驟然下降，致使瓶內(nèi)液體沖出瓶外
。
●現(xiàn)在最常用的培養(yǎng)基滅菌條件是15磅15分鐘，時(shí)間過長有可能破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。含
糖的生化培養(yǎng)基的滅菌條件是10磅(115.6℃)15分鐘。器皿的滅菌可以是15磅20分鐘。
二、紫外線殺菌試驗(yàn)(germicidal test of UV)
【材料】
大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物普通營養(yǎng)瓊脂平板滅菌的L形玻璃棒滅菌的“A”字形黑紙片
【方法】
1通過無菌操作，用接種環(huán)沾取大腸桿菌菌液放到平板培養(yǎng)基上，然后用滅菌的L形玻璃棒
均勻涂布于整個(gè)平板。
2鑷子在火焰上滅菌后，夾取滅菌的“A”字形紙片，置于瓊脂平板中央，然后將平板打
開，放在紫外線燈管下60～80cm處直接照射30分鐘。
3照射完畢，用無菌鑷子將黑紙片取出燒掉或投入消毒缸內(nèi)，隨即蓋好皿蓋，37℃培養(yǎng)24
小時(shí)，觀察和分析結(jié)果。
三化學(xué)消毒法(disinfection by chemical factors)
【材料】
大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物0.1%新潔爾滅2%紅汞2%龍膽紫生
理鹽水直徑6.5mm的滅菌濾紙圓片普通營養(yǎng)瓊脂平板
【方法】
1首先在瓊脂平板底部標(biāo)記上述化學(xué)消毒劑的名稱，留一對(duì)照位置。
2將葡萄球菌與大腸桿菌培養(yǎng)物分別均勻涂布于兩塊瓊脂平板培養(yǎng)基上。
3用滅菌鑷子夾取無菌濾紙片分別蘸取2%紅汞、2%龍膽紫、0.1%新潔爾滅、生理鹽水(對(duì)照
)，輕輕貼于瓊脂平板表面勿移動(dòng)，紙片間的距離約3cm。
4將平板置于37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。紙片周圍無細(xì)菌生長的區(qū)域，稱為抑菌環(huán)
。通過比較消毒劑的濃度與抑菌環(huán)直徑的大小，即可了解化學(xué)消毒劑的殺菌作用。
【思考題】
①高壓蒸汽滅菌法、紫外線、青霉素、碘酒的殺菌機(jī)理各是什么?
②影響化學(xué)消毒劑抑菌殺菌的因素有哪些?
③啤酒、飲料常用什么方法消毒?
④為什么說消毒與滅菌是微生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)必不可少的基本知識(shí)?
三細(xì)菌的分離與培養(yǎng)
Isolation And Culturing of Bacteria
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1掌握無菌操作技術(shù)。
2掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)所接觸的標(biāo)本，均來自臨床病人，大多數(shù)是含有病原菌而具有傳染性的材料。如
果操作和處理不當(dāng)，可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室感染和醫(yī)院內(nèi)感染。為此，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，特別是細(xì)菌培養(yǎng)
必須隨時(shí)為防止污染和病原菌的擴(kuò)散而進(jìn)行操作，為達(dá)此目的的技術(shù)就是無菌操作。
細(xì)菌的接種技術(shù)主要有：平板劃線分離法，斜面、液體或半固體培養(yǎng)基接種法。為避免在接
種過程中污染環(huán)境和空氣中的細(xì)菌污染培養(yǎng)物，細(xì)菌接種一般應(yīng)在超凈工作臺(tái)或無菌室內(nèi)進(jìn)
行。鑒于學(xué)生實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，要求學(xué)生在酒精燈旁進(jìn)行細(xì)菌接種。
細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)可分為：
(1)一般培養(yǎng)法即需氧培養(yǎng)法，將已接種好的培養(yǎng)基置于37℃恒
溫箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)，一般細(xì)菌即可在培養(yǎng)基中生長繁殖。
(2)CO2培養(yǎng)法某些細(xì)菌，如腦膜炎球菌、布氏桿菌等，需在增
加CO2的環(huán)境中培養(yǎng)才能生長良好，可采用CO2孵箱培養(yǎng)法、燭缸法、化學(xué)法。
(3)厭氧培養(yǎng)法(見綜合性實(shí)驗(yàn)二·厭氧菌的檢驗(yàn)一節(jié))
。
人工培養(yǎng)細(xì)菌在醫(yī)學(xué)中的實(shí)際應(yīng)用主要有四個(gè)方面：
(1)細(xì)菌的鑒定和研究細(xì)菌的人工培養(yǎng)是鑒定細(xì)菌種屬的基本手段。觀察細(xì)菌的形態(tài)，了
解各種細(xì)菌的培養(yǎng)特性、代謝活動(dòng)、生化反應(yīng)、抗原結(jié)構(gòu)、致病力等，均須首先培養(yǎng)純種細(xì)
菌，使其繁殖到足夠的數(shù)量。
(2)感染性疾病的診斷和防治由細(xì)菌所引起的感染性疾病，最確切最可靠的診斷依據(jù)(金標(biāo)
準(zhǔn))
是用人工培養(yǎng)法，從病人材料中把病原菌分離培養(yǎng)出來，并鑒定其種型。為選擇有效的抗菌
藥物對(duì)病人進(jìn)行合理治療，也必須通過人工培養(yǎng)方法，將從病人檢出的病原菌進(jìn)行藥物敏感
試驗(yàn)。
(3)生物制品的制備供某些傳染病血清學(xué)診斷使用的細(xì)菌診斷液、供預(yù)防接種用的活菌或
死菌菌苗和類毒素、供治療使用的免疫血清或抗毒素血清或微生態(tài)制劑等生物制品，在其制
備過程中均須進(jìn)行細(xì)菌的人工培養(yǎng)。
(4)菌種的保存從不同來源分離培養(yǎng)的菌株，以及實(shí)驗(yàn)室常備的標(biāo)準(zhǔn)菌株，常需保存較長
時(shí)間以備應(yīng)用。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一細(xì)菌分離培養(yǎng)法(isolation of pure culture)
細(xì)菌在自然界分布甚廣，種類繁多，被檢的臨床標(biāo)本常含有多種細(xì)菌，如果要證明該標(biāo)本中
是否存在某種細(xì)菌，或?qū)ｉT研究其中一種細(xì)菌等，必須進(jìn)行細(xì)菌分離與純化，獲得純種培養(yǎng)
物。
通常采用平板劃線法從臨床標(biāo)本中分離出病原菌，即：借助劃線而將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板
上分散開來，使單個(gè)細(xì)菌能固定在一點(diǎn)，在適宜的溫度下生長繁殖后，各自形成肉眼可見的
細(xì)菌集團(tuán)——單菌落，進(jìn)而根據(jù)菌落形態(tài)特征，將單菌落移植傳代后進(jìn)行大量增殖所得的菌
種，稱為純種微生物(純培養(yǎng))。
常用接種工具可分為接種針和接種環(huán)兩類。接種環(huán)用來挑取標(biāo)本菌液及劃菌落涂平板等。接
種針則用來挑取單個(gè)菌落，穿刺培養(yǎng)等。用于制作接種針或接種環(huán)的金屬絲通常用鎳鉻絲或
鉑絲做成，具有紅得快、冷得迅速、能經(jīng)受反復(fù)燒灼、不易氧化、無毒性，且軟硬適中等特
性。
【材料】
膿汁標(biāo)本糞便標(biāo)本普通營養(yǎng)瓊脂平板伊紅美藍(lán)瓊脂平板接種環(huán)酒精燈
【方法】
1右手拿接種環(huán)(如握筆式)，燒灼滅菌，欲伸入試管內(nèi)的接種環(huán)桿部分亦要迅速通過火焰2
～3次，以殺滅其表面的細(xì)菌。
2左手握住盛有標(biāo)本的試管的下端，右手以無名指、小指與手掌在火焰旁拔出試管棉塞并
挾住之，將管口迅速通過火焰三次滅菌。
3立即將已滅菌冷卻的接種環(huán)伸入試管內(nèi)，沾取標(biāo)本(或菌液)一環(huán)。試管口火焰滅菌后塞
好棉塞(無菌取材操作見圖2)。
圖2無菌取材的基本步驟
4左手斜持平板，略開蓋，在酒精燈火焰左前方約5～6cm處，將接種環(huán)上的菌液涂抹
于平板表面的邊緣部分。
5燒灼接種環(huán)，冷卻后，將接種環(huán)自涂抹部分沾取少許菌液，使接種環(huán)與平板
表面成30～4
0°角，用腕力將接種環(huán)在平板表面來回輕快地劃線，動(dòng)作要輕巧，劃線要密但不能重疊，
充分利用平板的面積。
圖3平板曲線劃線分離法
以上為曲線劃線分離法(見圖3)，多用于接種材料中含菌數(shù)量相對(duì)較少的標(biāo)本或培養(yǎng)物
。而
分區(qū)劃線分離法(見圖4)多用于糞便等含菌量較多的標(biāo)本，方法是：從原涂抹部分開始，連
續(xù)平行劃線，每次只劃平板的1/4～1/5，劃畢后接種環(huán)再經(jīng)火焰滅菌，冷卻后用同樣方法在
平板其余部分劃線，每次劃線要與前次劃線重疊1～3條，共計(jì)3～4次(區(qū))。
6接種完畢，將接種環(huán)燒灼滅菌后方可放下。
7將培養(yǎng)皿倒置(瓊脂平板的底部向上)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察結(jié)果。
圖4平板分區(qū)劃分離法
圖5瓊脂斜面接種的
好環(huán)映型
【注意事項(xiàng)】
●每次取菌(或接種)前后，均須燒灼接種工具，接種完畢，不能直接將接種環(huán)在火焰中燒灼
，以免環(huán)上的細(xì)菌或標(biāo)本因受高熱爆烈四濺，應(yīng)先將細(xì)菌或標(biāo)本烤干后再燒灼。
●不要?jiǎng)澠骗傊砻妗?/p>
●注意無菌操作，防止空氣中微生物掉入平板中造成污染。
●初學(xué)者可將平皿蓋打開放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，再行劃線接種。
二斜面培養(yǎng)基接種法(inoculation of slant medium)
用于細(xì)菌增殖和菌種傳代、保存。
【方法】(見圖5)
1右手拿接種針(環(huán))，燒灼滅菌(方法同前)，冷卻后，左手拿平板并略打開平皿蓋，通過
無菌操作挑取少許菌苔或一個(gè)單菌落。
2左手迅速放下平板，握住一個(gè)斜面培養(yǎng)基管的下端(斜面部應(yīng)向上，勿成水平，以免凝固
水浸濕培養(yǎng)基表面)。右手以無名指、小指與手掌在火焰旁拔出斜面培養(yǎng)基管棉塞并挾住之
，將管口迅速通過火焰三次滅菌。
3立即將接種針(環(huán))伸入斜面培養(yǎng)基管內(nèi)，在瓊脂表面先從底部向上行拉一線，然后自下
而上輕輕地作蜿蜒連續(xù)劃線，勿觸破培養(yǎng)基表面。
4接種完畢，試管口迅速通過火焰2～3次滅菌，塞好棉塞。接種環(huán)或針燒灼后方可放下。
5斜面培養(yǎng)基管置于37℃培養(yǎng)過夜。
三液體培養(yǎng)基接種法(inoculation of liquid medium)
用于測定細(xì)菌生化特性，觀察細(xì)菌的不同生長情況。
【方法】
1接種環(huán)接種法：通過無菌操作(方法同前)挑取菌苔少許或菌液一環(huán)，立即移入肉湯培養(yǎng)
基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混
勻。接種完畢，試管口迅速通過火焰2～3次滅菌，塞好棉塞。接種環(huán)燒灼后方可放下。
2移液管或滴管接種法：先擰斷移液管或滴管大口端的包扎紙，套上吸球抽出移液管，
并且不要觸及其他物體以防污染。左手拿菌種管，右手的拇指和食指夾住移液管和吸球，用
小指和掌邊拔出試管棉塞，將移液管或滴管伸入菌種管中，
吸取菌液后立即接種至肉湯培養(yǎng)基管或三角燒瓶中，然后管口火焰滅菌塞上棉塞，
充分搖動(dòng)幾下使菌液與培養(yǎng)基混勻
。帶菌的移液管或滴管應(yīng)浸入5%石炭酸缸中，至少浸30分鐘。
四半固體培養(yǎng)基接種法(穿刺接種法)(inoculation of semisolidmedium)
用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，即觀察細(xì)菌有無運(yùn)動(dòng)能力。
圖6半固體培養(yǎng)基穿剌
接種法
【方法】(見圖6)
1如斜面培養(yǎng)基接種法握持菌種管及待接種的半固體瓊脂培養(yǎng)基。
2右手握接種針，滅菌冷卻后，挑取菌苔少許，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，可刺
達(dá)近管底處，但不要達(dá)于管底，然后沿原路退出。
3接種完畢，試管口迅速通過火焰2～3次滅菌，塞好棉塞。接種針燒灼后方可放下。
4斜面培養(yǎng)基管置于37℃培養(yǎng)過夜。
【思考題】
①做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，平板為什么要倒放?
②培養(yǎng)細(xì)菌的常用方法有哪些?
③從臨床標(biāo)本中分離病原菌，應(yīng)注意哪些事項(xiàng)?
④為什么接種環(huán)在使用前、后都必須燒灼滅菌?忽略了有什么危害?
⑤半固體穿刺接種時(shí)，為什么要強(qiáng)調(diào)“原路返回”?
四細(xì)菌群體生長特征的觀察
Observation of Growth Characteristics of BacterialPopulation
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
了解并比較細(xì)菌在固體、半固體及液體培養(yǎng)基上的生長特征。
【實(shí)驗(yàn)原理】
不同的細(xì)菌生長在一定的培養(yǎng)基上往往有不同的特征，因此，培養(yǎng)特征可以作為細(xì)菌分類鑒
定的重要依據(jù)。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
一觀察細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長特征
1平板菌落特征
細(xì)菌在瓊脂平板上培養(yǎng)一定時(shí)間后，形成菌落。各種細(xì)菌菌落都有一定的特點(diǎn)，表現(xiàn)在以下
幾方面：
①大�。捍�(直徑約3mm以上)，中(直徑約1～3mm)，小(直徑約1mm以下)。
②形狀：圓形，卵圓形、假根形、絲狀、不規(guī)則等。
③邊緣：整齊，鋸齒狀，波浪狀，羽毛狀。
④表面：隆起、平坦、中心凸起、臍形凹陷；光滑或粗糙、濕潤或干燥。
⑤溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周圍呈草綠色、不透明)，溶血(菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán))
。
⑥色素：一般為無色或灰白色，特殊色素有兩類：脂溶性色素(菌落本身著色，培養(yǎng)基不著
色)和水溶性色素(菌落及培養(yǎng)基均著色)。
2斜面菌苔的特征
不同的細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基上生長，往往也具有一定的特征，表現(xiàn)在生長量、菌苔形狀(如線
狀、念珠狀、假根狀、薄膜狀等)、表面形狀、光澤、透明度、顏色等方面。
二細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長特征的觀察
細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長可出現(xiàn)肉眼可見的各種特征，如培養(yǎng)液渾濁或澄清，出現(xiàn)形態(tài)不一
(如絮狀、塊狀等)的沉淀，或在培養(yǎng)基表面形成菌膜(薄膜、厚膜或僅沿管壁產(chǎn)生一圈菌
膜即菌環(huán)等)。
三細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察
不同的細(xì)菌經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺接種后生長情況不同。能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，往往沿穿刺線擴(kuò)散生
長
(即有動(dòng)力)，而使穿刺線周圍出現(xiàn)模糊或混濁；不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌僅沿穿刺線生長；嚴(yán)格好氧
菌僅表面生長，兼性厭氧菌沿整個(gè)穿刺線生長。
五細(xì)菌個(gè)體形態(tài)特征的觀察
Observation of Morphologic Characteristics of Bacteria
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1掌握油鏡的正確使用。
2掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備。
3掌握革蘭氏染色法。
4熟悉細(xì)菌的基本形態(tài)。
5了解細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
細(xì)菌是一類具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞微生物，在一定環(huán)境下有相對(duì)恒定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。盡管細(xì)菌菌
落肉眼可見，但要觀察單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，必須借助光學(xué)顯微鏡將其放大900～1000倍，因此，
掌握顯微鏡的使用方法是研究細(xì)菌的基本技能。在微生物學(xué)中主要使用的是油鏡。油鏡是因
為在使用時(shí)需要香柏油作介質(zhì)而得名。
細(xì)菌菌體在強(qiáng)光下呈透明或半透明，其折光系數(shù)與玻璃片相似，在光學(xué)顯微鏡下難以看清楚
，所以，必須將細(xì)菌制成涂片，固定后，用化學(xué)染料使菌體著色，從而和周圍背景產(chǎn)生鮮明
對(duì)比，才能觀察到細(xì)菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。
染色方法有單染法和復(fù)染法。單染法是只用一種染料染色，如美藍(lán)或復(fù)紅，能清楚觀察菌體
大小、形態(tài)與排列，但不能鑒別細(xì)菌。復(fù)染法，即鑒別染色法，是用兩種或兩種以上染料，
可將細(xì)菌染成不同的顏色，用于協(xié)助鑒別細(xì)菌。常用的復(fù)染法有革蘭氏染色法和抗酸染色法
。
革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最為經(jīng)典的、廣泛應(yīng)用的染色法，可將細(xì)菌分成兩大類：革蘭氏陽
性(G+)菌和革蘭氏陰性(G-)菌。
革蘭氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三種學(xué)說：
(1)通透性學(xué)說：G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)
含量少，酒精不易透入，反
而可使細(xì)胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲。G-菌細(xì)胞壁比較疏松，肽聚糖
層
很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，
細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫—碘復(fù)合物容易被酒精脫出。
(2)等電學(xué)說：G+菌等電點(diǎn)(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般
染色時(shí)染液的酸堿度在pH7.0左
右，電離后陽性菌帶的負(fù)電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫
色。
(3)化學(xué)學(xué)說：G+菌細(xì)胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成分，一般認(rèn)為是
核
糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與染料—媒染劑復(fù)合物結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易脫色。
革蘭氏染色法的實(shí)際意義有鑒別細(xì)菌、指導(dǎo)臨床上選用有效藥物和了解細(xì)菌的致病
機(jī)理。在細(xì)菌分離培養(yǎng)或細(xì)菌藥敏試驗(yàn)來不及做的情況下，�？筛鶕�(jù)細(xì)菌涂片染色鏡檢的初
步結(jié)果來選擇用藥，有利于及早控制感染。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一油鏡的使用和保護(hù)(use and care of oilimmersionmicroscope)
1將顯微鏡平置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。
2轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器使低倍鏡與鏡筒垂直到位(聽到“咔”聲即可)。然后將反光鏡凹面對(duì)著
日光燈源翻動(dòng)，打開聚光器的光圈，將聚光器升至最高，側(cè)面觀察聚光器明亮或從目鏡觀察
視野明亮即說明對(duì)光完成。
3將標(biāo)本(標(biāo)本面向上)放入載物臺(tái)上的標(biāo)本夾中，先用低倍鏡找出標(biāo)本的范圍。
4在鏡頭對(duì)準(zhǔn)的玻片部位滴一滴香柏油，轉(zhuǎn)換油鏡(鏡頭刻有一個(gè)“HI”或“oil”字或標(biāo)
有100×)，眼睛從鏡筒側(cè)面看油鏡頭，將粗調(diào)節(jié)器作順時(shí)針或逆時(shí)針方向(取決于不同
型號(hào)的顯微鏡)緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)使鏡筒下降，并使油鏡頭浸泡于油中，幾乎與標(biāo)本接觸。然后用左
眼看目鏡，一面觀察，一面仔細(xì)調(diào)節(jié)微調(diào)節(jié)器使鏡頭提升，直到物像清楚為止。
5油鏡用畢，應(yīng)立即以擦鏡紙拭去香柏油，然后再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦拭，最后用干
凈擦鏡紙擦去二甲苯。將各物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，聚光器稍下降，以免接物鏡與聚光鏡相碰
受損，然后放入鏡箱。
【注意事項(xiàng)】
●取送顯微鏡時(shí)動(dòng)作要輕，一只手持鏡臂，一只手托鏡座，防止反光鏡、目鏡、物鏡等脫落
損壞。
●勿將鏡臂彎曲，因?yàn)槲⑸飳W(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)常使用油鏡，若載物臺(tái)傾斜，鏡油易流淌外溢，
影響觀察或造成污染。
●使用油鏡時(shí)，一定要等標(biāo)本干后才能滴加香柏油，滴油時(shí)應(yīng)避免氣泡形成。
●調(diào)焦時(shí)要特別謹(jǐn)慎，切忌采用眼睛對(duì)著目鏡邊觀察邊下降鏡筒的錯(cuò)誤操作，以免物鏡與玻
片相撞，損壞鏡頭和壓破標(biāo)本。
●油鏡用完后一定要擦洗，以防油干影響其使用壽命。
附錄
使用油鏡時(shí)，須加香柏油的原理(見圖7)是：油鏡的透鏡孔很小，自標(biāo)本玻片透過的光線，
圖7油浸鏡使用的原
理
因介質(zhì)密度(從載物玻片至空氣再進(jìn)入油鏡)不同，有些光線因折射或全反射 ，就不能進(jìn)入
透鏡，致使射入的光線較少，物象顯現(xiàn)不清，若在油鏡與載物玻片中間加入和玻璃折射率(n
=1.52)相仿的香柏油(n=1.515)，則不使通過的光線有所損失，進(jìn)入透鏡的光線即多，視野
的亮度也就增大了。
二細(xì)菌涂片(Smear)標(biāo)本的制備
細(xì)菌是膠體性物體，染色鏡檢時(shí)，必須經(jīng)過輕烤脫水使菌體固定在玻片上。固定的目的是：
①殺死細(xì)菌；②使菌體不易變形；③使菌體與玻片粘附較牢，在染色時(shí)不致被染液和水洗掉
；④使菌體蛋白變性易著色。
【材料】
膿汁標(biāo)本分離菌糞便標(biāo)本分離菌酒精燈接種環(huán)載玻片生理鹽水
圖8細(xì)菌涂片的制作
【方法】(見圖8)
1涂片：取潔凈的載玻片一張，用在火焰上燒過的接種環(huán)取生理鹽水1～2環(huán)于玻片上。接
種環(huán)滅菌后，挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕磨勻，涂抹成直徑1厘米大小的均勻薄膜。臨
床標(biāo)本如膿汁、痰、分泌物等可直接涂片。
2干燥：涂片最好在室溫中自然干燥，必要時(shí)可將涂片膜面向上，小心間斷地在弱火高處
略烘，以助水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后難以檢查。
3固定：手持玻片的一端，標(biāo)本面朝上，在火焰外層快速地來回通過2～3次，共約2～3秒
，使標(biāo)本固定，即可進(jìn)行染色。
【注意事項(xiàng)】
●涂片不可過厚，一定要涂成薄膜。
●涂片必須注意輕輕操作，如果動(dòng)作過猛，可能會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，造成飛沫傳染。
●固定要適當(dāng)，溫度不宜過高，否則可能使細(xì)胞形態(tài)改變。
三革蘭氏染色法(Gram′s stain)
【材料】
結(jié)晶紫染液(第1液)蘆戈氏碘液(第2液)95%酒精(第3液)稀釋石炭酸復(fù)紅(第4液)染
色架吸水紙
【方法】
1初染：在已固定的細(xì)菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液1～2滴，經(jīng)1分鐘后用細(xì)流水緩緩沖洗，并
傾去玻片上余水。
2媒染：加蘆戈氏碘液1～2滴，經(jīng)1分鐘后用細(xì)流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。媒染劑
的作用是增加染料和細(xì)胞之間的親和性或附著力，不易脫落。
3脫色：滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的
染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色或稍淡紫色為止(約需20～30秒)，立即
用細(xì)流水將酒精沖掉，并傾去玻片上余水。
4復(fù)染：加稀釋復(fù)紅1～2滴，經(jīng)30秒～1分鐘后用細(xì)流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。
標(biāo)本涼干后，滴加香柏油，用油鏡觀察，革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。
【注意事項(xiàng)】
●革蘭氏染色時(shí)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)是脫色。若脫色不夠，革蘭氏陰性菌可被染成陽性菌；脫色過度
，革蘭氏陽性菌可被脫色而誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌。
四細(xì)菌的基本形態(tài)與特殊結(jié)構(gòu)的觀察
【材料】
1.球菌示教片：葡萄球菌淋球菌
2.桿菌示教片：大腸桿菌痢疾桿菌
3.螺菌示教片：幽門螺桿菌霍亂弧菌
4.特殊結(jié)構(gòu)示教片：鞭毛(傷寒桿菌)芽胞(破傷風(fēng)桿菌)莢膜(肺炎鏈球菌)
【思考題】
①如何使用油鏡?
②革蘭氏染色法的關(guān)鍵步驟是什么?為什么?
③染色時(shí)為什么通常要用新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物?
六細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定
Characterization of Bacteria by Biochemical Reaction
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1熟悉幾種常用的細(xì)菌生化反應(yīng)的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途。
2掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的原理、方法及用途。
【實(shí)驗(yàn)原理】
由于細(xì)菌的種類和基因結(jié)構(gòu)不同，所形成的獨(dú)特酶系也不同，故對(duì)糖和蛋白質(zhì)的分解能力及
其代謝產(chǎn)物亦不一，能表現(xiàn)各自的特點(diǎn)。據(jù)此采用生化反應(yīng)檢測細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用
及其代謝產(chǎn)物(分解代謝和合成代謝產(chǎn)物)，不僅可以區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類，而且可以探討
細(xì)菌的生活規(guī)律、代謝機(jī)理及其與周圍環(huán)境物質(zhì)之間的關(guān)系。
不同細(xì)菌分解糖類的能力不同，分解產(chǎn)物也不一樣。有的細(xì)菌能分解某些糖類而產(chǎn)生多種酸
(如乳酸、醋酸等)和氣體(如H2、CO2等)，有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。有的細(xì)菌不能分解某些
糖。某些細(xì)
菌能分解蛋白質(zhì)中的胱氨酸等含巰基氨基酸，形成硫化氫。硫化氫遇醋酸鉛或硫酸亞鐵則形
成黑褐色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。借此可協(xié)助鑒別菌種。
細(xì)菌在生長繁殖過程中，還能產(chǎn)生一些具有鑒別意義的酶，如：
(1)幽門螺桿菌能在胃中(酸性環(huán)境)定植和生長，其中一個(gè)重要原因是該菌產(chǎn)生大量的尿素
酶，分解尿素釋放出氨，從而緩沖酸性pH的作用，造成一個(gè)局部的中性微環(huán)境。
(2)致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，能使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔等動(dòng)物血
漿發(fā)生凝固，凝固的血漿沉積于菌體表面，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬，或即使被吞噬，也不易被
殺死，從而有利于細(xì)菌繁殖，引起感染。在臨床微生物學(xué)檢查中，血漿凝固酶是鑒別葡萄球
菌有無致病性的重要指標(biāo)。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
1糖發(fā)酵試驗(yàn)(sugar fermentation test)
單糖發(fā)酵微量管是只含有一種糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并加入一定量的指
示劑。接種細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后，若該菌具有分解該糖的酶，有酸產(chǎn)生時(shí)就能使指示劑變色。如指
示劑為酸性復(fù)紅［pH4.2(紅色)～6.2(黃色)］，則變成紅色；溴甲酚紫［pH5.2(黃色)～6.8
(紫色)］則呈黃色。若有氣體產(chǎn)生，則微量管內(nèi)集聚氣泡。
【材料】
糞便標(biāo)本分離菌接種針小砂輪葡萄糖發(fā)酵微量管(管底紅色)乳糖發(fā)酵微量管(管底
黃色)
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針刮取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，分別接種在葡萄糖發(fā)酵微
量管和乳糖發(fā)酵微量管內(nèi)。
2將微量管平放在平皿蓋內(nèi)，37℃培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。
3結(jié)果判斷：如培養(yǎng)基中指示劑顏色未變時(shí)，表明細(xì)菌不分解糖，以“-”表示。如顏色改
變時(shí)為細(xì)菌分解糖產(chǎn)酸，以“+”表示；如果同時(shí)有氣泡產(chǎn)生時(shí)，則為細(xì)菌分解糖產(chǎn)酸又產(chǎn)
氣，以“”表示。
【注意事項(xiàng)】
●觀察結(jié)果時(shí)，應(yīng)先觀察是否產(chǎn)氣，切勿將微量管豎立，以免氣體溢出。
二甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)(mannitol fermentation test)
【材料】
膿汁標(biāo)本分離菌甘露醇微量管
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針挑取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，接種在甘露醇微量管內(nèi)。
237℃培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。
3結(jié)果判斷：培養(yǎng)基中指示劑顏色改變時(shí)為細(xì)菌分解甘露醇產(chǎn)酸，以“+”表示，不變?yōu)殛?/p>
性反應(yīng)。
三硫化氫試驗(yàn)(hydrogen sulfide test)
【材料】
糞便標(biāo)本分離菌硫化氫微量管
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針挑取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，接種在醋酸鉛微量管內(nèi)。
237℃培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。
結(jié)果判斷：醋酸鉛培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉淀為陽性反應(yīng)，不變?yōu)殛幮苑磻?yīng)。
四尿素分解試驗(yàn)(ureasplitting test)
細(xì)菌產(chǎn)生的尿素酶能分解尿素形成大量的氨，使培養(yǎng)基酸堿度上升而變成堿性，酚紅指
示劑呈現(xiàn)紅色，是為陽性反應(yīng)。
【材料】
糞便標(biāo)本分離菌尿素微量管
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針挑取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，接種在尿素微量管內(nèi)。
237℃培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。
3結(jié)果判斷：尿素培養(yǎng)基從黃色變?yōu)榧t色者為陽性反應(yīng)，不變?yōu)殛幮苑磻?yīng)。
五血漿凝固酶試驗(yàn)(coagulase test)
【材料】
膿汁標(biāo)本分離菌兔血漿生理鹽水載玻片
【方法】
1取干凈玻片一塊，用計(jì)號(hào)筆將玻片分為兩格，其中一格加兔血漿1～2滴，另一格加生理
鹽水1滴。
2將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌冷卻后，取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，在生理鹽水中研磨
混勻成細(xì)菌懸液。
3用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌懸液1環(huán)，或挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許，在兔血漿中輕輕磨勻。
4稍待片刻，觀察結(jié)果。
5結(jié)果判斷：先觀察生理鹽水對(duì)照，應(yīng)呈均勻混濁現(xiàn)象。再觀察細(xì)菌與兔血漿混合物，
若有凝塊出現(xiàn)，則為陽性；無凝塊出現(xiàn)為陰性。
【注意事項(xiàng)】
●兔血漿和細(xì)菌培養(yǎng)物要適量，以免干燥，難以觀察結(jié)果。
【思考題】
①細(xì)菌生化反應(yīng)在感染性疾病診斷中有何重要意義?為什么?
②分析本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如結(jié)果不佳，原因何在?
③為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，你認(rèn)為上述試驗(yàn)應(yīng)還設(shè)立哪些對(duì)照?
七細(xì)菌血清學(xué)反應(yīng)鑒定
Characterization of Bacteria by Serological Reaction
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果觀察與判斷。
2熟悉肥達(dá)氏反應(yīng)的原理、方法、結(jié)果判斷和分析。
【實(shí)驗(yàn)原理】
血清學(xué)反應(yīng)是指抗原抗體www.med126.com在體外的特異性結(jié)合反應(yīng)，可用已知抗原檢測未知抗體或用已知抗
體檢測未知抗原。常見的有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等。血清學(xué)反應(yīng)
常用于傳染病的診斷和微生物菌株的鑒定。
將已知的抗體(診斷血清)直接與未知的顆粒性抗原物質(zhì)(如細(xì)菌)混合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在
條件下，如兩者對(duì)應(yīng)便發(fā)生特異性結(jié)合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對(duì)應(yīng)
便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性，稱為直接凝集反應(yīng)，屬定性試驗(yàn)，有玻片法和試管法兩種，主
要用于檢測抗原，如菌種的鑒定與分型、ABO血型鑒定等。
用各種標(biāo)準(zhǔn)的傷寒桿菌H、O抗原和甲型副傷寒H抗原、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人不同稀釋
倍數(shù)的血清做定量凝集試驗(yàn)，稱為肥達(dá)氏反應(yīng)，可用于測定患者血清中相應(yīng)抗體的含量及其
增減情況，以輔助腸熱癥(傷寒和副傷寒)的診斷。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一玻片凝集試驗(yàn)(slide agglutination test)
【材料】
載玻片診斷血清糞便標(biāo)本分離菌
【方法】
1取干凈載玻片二張，用計(jì)號(hào)筆將玻片分為兩格，分別加入大腸桿菌診斷血清、痢疾桿菌
診斷血清、傷寒桿菌診斷血清、乙型副傷寒桿菌診斷血清各1～2滴。
2將接種環(huán)燒灼滅菌、冷卻后，取細(xì)菌培養(yǎng)物少許，分別在4種診斷血清中研磨混勻，接
種環(huán)作滅菌處理后方可放下。
3如上述混合懸液由均勻混濁變?yōu)槌吻逋该�，并出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者即為陽性
；如混合物仍呈均勻混濁則為陰性。如肉眼觀察不夠清楚，可將玻片置于顯微鏡下用低倍鏡
觀察。一般可立即出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，如結(jié)果不明顯，可轉(zhuǎn)動(dòng)玻片數(shù)次。2～3分鐘仍不出現(xiàn)凝集
者，可認(rèn)為陰性。
4觀察完畢，將載玻片立即放入指定的消毒缸內(nèi)(為什么?)
【注意事項(xiàng)】
●診斷血清和細(xì)菌培養(yǎng)物比例要適量，以免干燥，來不及觀察結(jié)果。
●每一菌株應(yīng)同時(shí)作生理鹽水對(duì)照，防止誤將細(xì)菌自凝現(xiàn)象認(rèn)為凝集反應(yīng)。
二肥達(dá)氏反應(yīng)(widal test)
【材料】
病人血清甲型副傷寒桿菌“H”菌液乙型副傷寒桿菌“H”菌液傷寒桿菌“H”菌液與
“O”菌液試管吸管吸頭生理鹽水37℃水浴箱
【方法】
1取小試管28支，在試管架上排成4排，每排7支。
2在中試管加入生理鹽水3.8ml，再換一支吸管，吸取患者血清(須先經(jīng)56℃，30分鐘滅活)
0.2ml，并用原吸管吸吹3次混勻(這時(shí)血清稀釋度為1∶20)。
3取1∶20血清2ml，在每排第1管中各加入0.5ml。
4吸生理鹽水2ml，加入到上述中試管中，與余下的2ml1∶20的血清混勻，即稀釋成1∶40
。然后吸取2ml1∶40的血清，向每排第2管中各加入0.5ml。
5按上法將血清不斷做倍比稀釋，并依次加入各管，直至每排第6管止。
6各排第7管不加血清，各加入生理鹽水0.5ml作為對(duì)照。
7依7、6、5……1管的順序，加入菌液：
第1排各管中加入傷寒桿菌“H”菌液0.5ml。
第2排各管中加入傷寒桿菌“O”菌液0.5ml。
第3排各管中加入甲型副傷寒桿菌“H”菌液0.5ml。
第4排各管中加入乙型副傷寒桿菌“H”菌液0.5ml。
這時(shí)每排各管中血清的最終稀釋度如下：
試管序號(hào)〖〗1〖〗2〖〗3〖
〗4〖〗5〖〗6〖〗7
血清稀釋度〖〗1∶40〖〗1∶80〖〗1∶160〖〗1∶320〖〗1∶640〖〗1∶1280〖〗——
8將各管中懸液混勻，置37℃水浴箱中2小時(shí)，取出置室溫過夜，次日觀察結(jié)果。
附：結(jié)果判斷與分析
先看各排對(duì)照管，應(yīng)無凝集，懸液仍然均勻混濁，或僅有極少量菌體沉于管底呈一集中的小
點(diǎn)；傷寒桿菌“H”抗原、甲型和乙型副傷寒桿菌“H”抗原與相應(yīng)抗體的凝集塊呈絮狀疏松
，沉于管底，輕搖時(shí)沉淀物極易浮起，且易破碎；傷寒桿菌“O”抗原的凝集較緊密，呈顆
粒狀沉于管底。
根據(jù)凝集反應(yīng)的強(qiáng)弱，分別以、、、＋記錄之。
：液體清徹透明，菌體全部被凝成塊，沉于管底。
：液體較透明，菌體大部分被凝集而沉于管底。
：液體稍透明，管底有少量凝集沉淀物。
＋：液體較混濁，可見極少量凝集沉淀物。
-：液體的混濁度及管底沉淀物與對(duì)照管相似，無沉淀。
一般以出現(xiàn)凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清對(duì)某抗原的凝集效價(jià)。
在分析結(jié)果時(shí)，首先應(yīng)考慮當(dāng)?shù)卣Ｈ诵r(jià)。一般以單份血清凝集效價(jià)：傷寒O應(yīng)達(dá)1∶80以
上、傷寒H應(yīng)達(dá)1∶160以上，甲型和乙型副傷寒H應(yīng)達(dá)1∶80以上才有診斷價(jià)值。若第二次血
清效價(jià)比第一次高4倍以上，有診斷價(jià)值。
【思考題】
1、血漿凝固酶試驗(yàn)和玻片凝集試驗(yàn)觀察完畢，應(yīng)將載玻片立即放入消毒缸內(nèi)，為什么?
2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試分析標(biāo)本中可能有何種細(xì)菌，為什么?
八細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)
Test of Susceptibility of Bacteria to Drug
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1熟悉藥物敏感性試驗(yàn)方法的種類、原理及應(yīng)用。
2掌握紙片擴(kuò)散法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
自從抗生素、磺胺類等抗菌藥物廣泛應(yīng)用以來，致病菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性的情況日益增
多，并以金黃色葡萄球菌、結(jié)核桿菌、痢疾桿菌、銅綠色假單胞菌、大腸桿菌等尤為突出。
細(xì)菌耐藥性變異，是臨床工作中必須注意的問題。為了防止細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和確保治療效果
，在用抗生素治療前，應(yīng)做細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)，選用敏感的藥物進(jìn)行治療，避免為耐藥性
突變的菌株提供選擇和發(fā)展的條件，這就要求細(xì)菌學(xué)工作者必須保證藥敏試驗(yàn)結(jié)果高度準(zhǔn)確
性。
細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性試驗(yàn)方法有：
(1)液體稀釋法：在試管中加入一定量適于測試菌生長的液體培養(yǎng)基作為稀釋液，將不同劑
量的藥物加入各管中，使形成一組含不同遞減濃度的藥物試管，然后逐管加入一定量的測試
菌，在合適溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，用肉眼觀察其混濁度或用光電比色計(jì)作比濁測定，以不
長菌管的最低藥物劑量為該藥的MIC；
(2)瓊脂稀釋法：將不同劑量的藥物與一定量融化的固體培養(yǎng)基相混合，制成含不同遞減濃
度的藥物平板，然后將一定量的測試菌接種于含藥平板上，在合適溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，
觀察測試菌的生長情況，以不長菌的平板所含最低藥物劑量為該藥的MIC；
(3)紙片擴(kuò)散法：是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴(kuò)散滲透作用，將含已知濃度的藥物濾紙片
貼于含有敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，抗生素就自紙片向平板四周擴(kuò)散滲透，在抑菌濃
度所達(dá)范圍內(nèi)敏感菌的生長被抑制而出現(xiàn)抑菌圈，通過比較抗生素濃度與抑菌圈的大小以測
定抗生素的抑菌濃度。
細(xì)菌藥敏試驗(yàn)中所用的專門名詞解釋如下：
最低抑菌濃度(Minimal InhibitoryConcentration,MIC)：抗菌藥
物能夠抑制細(xì)菌生長所需要的最低濃度。
最低殺菌濃度(Minimal BacteriacidieConcentration,MBC)：抗
菌藥物殺滅細(xì)菌所需要的最低濃度。
敏感(Sensitive)：常用量預(yù)期有效。
中度敏感(Moderate sensitive)：常用量體內(nèi)藥物濃度較高的部
位或超常用量增加血中藥物濃度預(yù)期有效。
耐藥(Resistant)：常用量預(yù)期無效。
病原菌對(duì)某種抗菌藥物敏感、中度敏感和耐藥的分界點(diǎn)是根據(jù)該菌在血中的治療濃度和病原
菌對(duì)該藥物的最小抑菌濃度而確定的。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一紙片瓊脂擴(kuò)散法(Kirby Bauer method)
本法快速、簡便，已為多數(shù)臨床細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室所采用。
【材料】
膿汁標(biāo)本病原菌糞便標(biāo)本病原菌MullerHinton瓊脂平板肉湯培養(yǎng)基青霉素、鏈霉
素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片尺
圖9紙片法藥敏試
驗(yàn)圖型
【方法】
1培養(yǎng)基制備MH瓊脂(pH7.2～7.4)傾注入直徑9cm平皿中，厚
度約為4mm。臨用時(shí)，半開
蓋平板，倒置于35℃培養(yǎng)箱10～20分鐘使表面干燥。鏈球菌或其他較難生長的細(xì)菌可在上述
培養(yǎng)基中加入5%無菌脫纖維羊血。
2被檢菌液的制備挑取單菌落4～5個(gè)，接種于4～5ml肉湯培養(yǎng)
基內(nèi)，置35℃孵育4～6小
時(shí)，使菌液達(dá)到或超過1.5×108/ml麥?zhǔn)媳葷峁軡舛取＜尤霚缇}水，使其濃度與標(biāo)準(zhǔn)管
一致。
3接種制備好的接種菌液必須在15分鐘內(nèi)使用。用無菌棉拭沾
取新鮮菌液，涂布接種于M
H瓊脂表面，重復(fù)三次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60度，保證菌液均勻分布。蓋好平皿，放置5分鐘，
待平板表面水分被瓊脂完全吸收。
4貼抗菌紙片用無菌眼科鑷子夾取抗生素濾紙片(直徑為6.35mm
，每片吸水量約為20μl)
，分別貼在平板上。用鑷尖壓一下，使其貼平。各濾紙片之間距離應(yīng)基本相等(不少于24cm)
，紙片中心距平皿邊緣約15mm。在平板底面上做好標(biāo)記。在15分鐘內(nèi)將平板置35℃培養(yǎng)18～
24小時(shí)后取出觀察結(jié)果。
5結(jié)果判斷如細(xì)菌對(duì)藥物敏感，則含該藥物的濾紙片周圍無菌
生長。無菌生長的區(qū)域稱
抑菌環(huán)。如細(xì)菌對(duì)該藥物具有耐性，則無抑菌環(huán)或抑菌環(huán)直徑較小。記錄并比較抑菌環(huán)直徑
大小，判斷細(xì)菌的敏感性。
6同時(shí)接種質(zhì)(量)控(制)菌株作為陽性對(duì)照。KB法質(zhì)控用菌株常規(guī)有三種，分別是金黃
色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。生理鹽水紙片作為
陰性對(duì)照。
常用藥敏試驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)
抗菌藥物〖〗紙片含藥量〖〗抑菌圈直徑(mm)〖〗耐藥中度敏感敏
感
青霉素G(葡萄球菌)〖〗10單位〖〗≤28〖〗-〖〗≥29
鏈霉素〖〗10微克〖〗≤11〖〗12-14〖〗≥15
慶大霉素〖〗10微克〖〗≤12〖〗13-14〖〗≥15
四環(huán)素〖〗30微克〖〗≤14〖〗15-18〖〗≥19
【注意事項(xiàng)】
●購取抗生素濾紙片因產(chǎn)地不同，紙片含藥量也可能不同，因此在判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)注意參照標(biāo)
準(zhǔn)。
●結(jié)果的讀取應(yīng)首先測量質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)直徑，如在允許范圍內(nèi)，被檢菌結(jié)果才可信。
二瓊脂平板稀釋法(agar dilution method)
瓊脂平板稀釋法藥敏試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：(1)比液體稀釋法重復(fù)性好；(2)可同時(shí)檢測多種被檢菌；
(3)可發(fā)現(xiàn)混合菌和污染菌；(4)可觀察菌落生長良好與否。因此，WHO推薦此法為細(xì)菌藥敏
試驗(yàn)最佳方法。
【方法】
1制備含不同濃度抗菌藥物營養(yǎng)瓊脂平板，當(dāng)瓊脂溫度在50℃左右時(shí)加入抗菌藥物，溫度
過高，抗菌藥物受破壞，溫度過低則藥物不能混勻。
2接種新鮮菌液。用接種環(huán)接種5～8mm圓形區(qū)，
同時(shí)接種被檢菌和已知MIC的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。
335℃培養(yǎng)18～24小時(shí)后，以完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為被檢菌的MIC，薄層極微
弱生長或只生長1～2個(gè)菌落可忽略。陽性對(duì)照(不含抗菌藥物)培養(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)接近融合生長。
附：藥敏自動(dòng)化檢測系統(tǒng)
目前有MIC2000，MS2，Cobas Bact和Vitek AMS等。這些儀器基本原理是利用光學(xué)手段
監(jiān)測細(xì)菌增殖的程度。以只含菌不含藥的小管(或小凹)內(nèi)的光學(xué)濁度(或透明度)的增長程度
與含藥和細(xì)菌的小管(或小凹)內(nèi)的細(xì)菌增殖程度，對(duì)比判斷敏感(S)、中度敏感(MS)或耐藥(
R)。
一般而言，自動(dòng)化檢測儀主要優(yōu)點(diǎn)是可快速(約4～5小時(shí))獲得藥敏結(jié)果，且可同時(shí)測十
多種抗菌藥物，臨床醫(yī)師可及時(shí)選用有效治療藥物，縮短住院日期，降低醫(yī)藥費(fèi)用。但不論
哪種自動(dòng)化檢測儀均不能完全代替WHO推薦的藥敏試驗(yàn)方法。Vitek AMS與KB擴(kuò)散法的符合
率95～98%，CobasBact與KB擴(kuò)散法符合率88.1～90.1%。特別值得注意的是，自動(dòng)化檢測
儀
不能檢出某些異型耐藥菌株，有時(shí)誤將耐藥報(bào)告為敏感。AMS也不能發(fā)現(xiàn)污染菌株，可能將
敏感報(bào)成耐藥。而KB法可察覺異型耐藥菌株和污染菌株。AMS可避免擴(kuò)散慢的藥物如SXT藥
敏試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假耐藥，而KB法則不能避免。
【思考題】
1、抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)有何實(shí)際意義?
2、報(bào)告紙片法試驗(yàn)結(jié)果，是否符合你所鑒定的細(xì)菌的藥敏特性?
3、細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)要設(shè)立哪些對(duì)照?為什么要設(shè)立這些對(duì)照?
九.細(xì)菌的動(dòng)物感染與致病性試驗(yàn)
Animal Infection And Pathogenicity Tests of Bacteria
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
1掌握細(xì)菌動(dòng)物感染的常用方法。
2了解感染動(dòng)物的細(xì)菌學(xué)檢查原則。
3了解細(xì)菌外毒素和內(nèi)毒素測定的原理和方法。
【實(shí)驗(yàn)原理】
為了證明人類的某特定感染性疾病是由特定病原菌引起的，必須采取Koch準(zhǔn)則的所有步驟，
即：
①在同一特定疾病的機(jī)體中常能發(fā)現(xiàn)同一種病原菌；
②能從患病機(jī)體中分離出這種病原菌，并獲得純培養(yǎng)；
③將這種培養(yǎng)物接種到易感動(dòng)物體，應(yīng)能引起相同的疾��；
④能從感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中重新分離出與原接種菌相同的病原菌，并獲得純培養(yǎng)。
這或許需要在人身上進(jìn)行某些不合道德的、而又迫不得已的科學(xué)實(shí)驗(yàn)。但是，并不是在所有
情形下都有可能采取這些步驟，如不宜在人體中做鼠疫桿菌感染實(shí)驗(yàn)。因此，通常需要在動(dòng)
物體中進(jìn)行微生物感染實(shí)驗(yàn)。
細(xì)菌的動(dòng)物感染應(yīng)用十分廣泛，如：①細(xì)菌的鑒別和診斷；②細(xì)菌致病物質(zhì)和致病機(jī)理的研
究；③考察抗菌藥物和生物制品的療效；④制備各種免疫血清及抗毒素。
不同的細(xì)菌對(duì)動(dòng)物的易感性不一，感染的途徑也不一，因此，在進(jìn)行細(xì)菌的動(dòng)物感染時(shí)應(yīng)選
擇易感動(dòng)物，確定適當(dāng)?shù)母腥就緩�，�?yán)格執(zhí)行無菌操作。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小鼠、豚鼠、家
兔等。為使動(dòng)物試驗(yàn)正確、可靠，必須按實(shí)驗(yàn)要求，選擇動(dòng)物種、系及體質(zhì)健康，生長發(fā)育
良好，一定的體重和年齡，具有高度敏感(或易感)性，且飼養(yǎng)管理比較方便的動(dòng)物。
病原菌突破機(jī)體的屏障結(jié)構(gòu)并定居于某組織后，能適應(yīng)機(jī)體生化環(huán)境進(jìn)行生長繁殖，其中大
多數(shù)細(xì)菌能產(chǎn)生毒性酶(如血漿凝固酶、透明質(zhì)酸酶)，構(gòu)成細(xì)菌的侵襲力，同時(shí)合成和釋放
毒素(內(nèi)毒素和外毒素)，引起宿主的損傷而致病。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法】
一動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)感染方法與感染動(dòng)物的細(xì)菌學(xué)檢查
(infecting method of experimental animal and bacterial examination ofinfected a
nimal)
根據(jù)病原菌不同，可采用不同的接種法，如腹腔內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腦內(nèi)接種
、眼角膜接種、肌肉注射和喂飼接種法等。
【材料】
小白鼠肺炎球菌菌液無菌注射器及針頭碘酒、酒精棉球
【方法】
1、用無菌注射器以無菌操作要求吸取肺炎球菌菌液，吸取量稍多于使用量，注射器內(nèi)不能
有氣泡，故吸入菌液后應(yīng)將注射器針頭朝上，在針頭上裹以消毒棉花，使氣泡上升，然后輕
輕推出，避免菌液四濺，特別注意防止眼結(jié)膜感染。
2、用右手輕輕拖鼠尾，使其爬行于粗物表面上再以左手拇、食兩指抓緊小白鼠兩耳及其頸
項(xiàng)皮膚，使鼠體被固定在左手掌間，以左手無名指或小指夾住鼠尾及左后腿，然后用碘酒消
毒腹壁皮膚。
3、左手傾斜，使小白鼠頭部稍向下，將預(yù)先準(zhǔn)備的菌液注入腹腔內(nèi)，注射時(shí)右手持已吸有
菌液的注射器，針尖自小鼠左側(cè)腹股溝處刺穿皮膚，使針尖在皮下組織內(nèi)向前移行約1厘米
左右，然后再輕輕向下刺進(jìn)腹腔，抽吸注射器，如無回血或尿液，表示針頭未刺入肝、膀胱
等臟器，即可注射。
4、接種完畢，將小白鼠標(biāo)以記號(hào)，置入鼠罐中，并填寫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)記錄卡或標(biāo)簽，注明試驗(yàn)
動(dòng)物名稱、編號(hào)、注射材料、部位、劑量以及注射日期，然后將卡片掛在動(dòng)物容器上。
5、感染動(dòng)物予以隔離喂養(yǎng)，并逐日觀察，注意有無發(fā)病癥狀，如食欲不振，豎毛，不活潑
等現(xiàn)象，并加以記錄，必要時(shí)定期測量體重及體溫，若有致死可能，務(wù)必在動(dòng)物瀕死前及時(shí)
殺死，作病原學(xué)分離與病原學(xué)檢查。
6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或患病動(dòng)物的細(xì)菌檢查應(yīng)根據(jù)病原菌不同，采集不同的標(biāo)本，如血、尿、糞便
、內(nèi)臟等。對(duì)待檢標(biāo)本，可進(jìn)行直接涂片、染色鏡檢，或進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定。
二透明質(zhì)酸酶實(shí)驗(yàn)(spreading test of hyaluronidase)
透明質(zhì)酸酶，又稱擴(kuò)散因子，能溶解機(jī)體結(jié)締組織中的透明質(zhì)酸，使組織疏松，通透性增加
，使病菌易在組織中擴(kuò)散、病灶擴(kuò)大。
【材料】
家兔碘酒、酒精棉球無菌注射器墨汁(或美蘭)溶血性鏈球菌培養(yǎng)物(或透明質(zhì)酸酶
溶液)生理鹽水。
【方法】
1取家兔一只，將其背部兩側(cè)毛剪去，用碘酒、酒精消毒。
2用注射器吸取0.1ml墨汁(或美蘭)和0.1ml溶血性鏈球菌培養(yǎng)物(或含透明質(zhì)酸酶600單位
的溶液)，注射一側(cè)皮內(nèi)。
3于另一側(cè)背部皮內(nèi)注射0.1ml墨汁和0.1ml生理鹽水，作為對(duì)照。
4注射后1小時(shí)后觀察結(jié)果，比較兩側(cè)墨汁擴(kuò)散范圍的大小。
三內(nèi)毒素的致熱實(shí)驗(yàn)(fever action of endotoxin)
內(nèi)毒素具有多種生物學(xué)活性，主要毒性作用有發(fā)熱反應(yīng)、白細(xì)胞反應(yīng)、休克等。將含內(nèi)毒素
的細(xì)菌培養(yǎng)物注入動(dòng)物體內(nèi)，由于內(nèi)毒素的毒性作用，動(dòng)物可表現(xiàn)出這些癥狀。
【材料】
家兔內(nèi)毒素(傷寒桿菌培養(yǎng)濾液)半導(dǎo)體點(diǎn)溫度計(jì)無菌注射器碘酒、酒精棉球
【方法】
1注射內(nèi)毒素前，用半導(dǎo)體測溫計(jì)固定測量家兔耳內(nèi)凹處皮膚體溫，并記錄結(jié)果。
2以手指輕彈兔耳，去毛，壓迫耳根部靜脈，使耳外緣部靜脈充血而怒張，然后先用碘酒
，再用酒精消毒，用無菌注射器吸取內(nèi)毒素0.5ml，注入兔耳靜脈內(nèi)。
3另取一只家兔，同法注射生理鹽水0.5ml，作為對(duì)照。
4注射后，每間隔20分鐘測量一次體溫，直至2小時(shí)為止，并記錄結(jié)果，觀察是否體溫升
高。
四破傷風(fēng)外毒素的毒性作用實(shí)驗(yàn)
(toxic action of Tetanus exotoxin)
破傷風(fēng)桿菌外毒素(痙攣毒素)是一種神經(jīng)毒素，對(duì)腦干神經(jīng)和脊髓前角神經(jīng)細(xì)胞有高度親和
性，以毒害中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主，有導(dǎo)致肌肉強(qiáng)直性痙攣等一系列表現(xiàn)。
【方法】
1取健康小白鼠二只，將其后腿用碘酒、酒精消毒后，一只經(jīng)肌肉注射破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)濾
液(含破傷風(fēng)外毒素)0.1ml；另一只注射肉湯培養(yǎng)基0.1ml作對(duì)照，分別將二只小白鼠放入已
標(biāo)記好的鼠缸內(nèi)。
2填寫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)記錄卡片，注明試驗(yàn)動(dòng)物名稱、記號(hào)、注射材料、部位、劑量以及注射日
期等，然后貼于鼠籠上。
3每隔2小時(shí)觀察一次。小白鼠尾巴強(qiáng)直，注射毒素側(cè)的下肢麻痹，呈強(qiáng)直性痙攣，隨著時(shí)
間的延長，癥狀逐漸加劇，并可見全身肌肉痙攣、角弓反張等現(xiàn)象，1～2日內(nèi)小白鼠死亡。
對(duì)照小白鼠無異常表現(xiàn)。
【思考題】
請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)破傷風(fēng)抗毒素中和作用的實(shí)驗(yàn)方案。
十微生物快速診斷新技術(shù)
自1876年Koch創(chuàng)用固體培養(yǎng)法分離培養(yǎng)細(xì)菌以來迄今的百余年中，微生物診斷技術(shù)的進(jìn)展大
體可分為三個(gè)階段。
第一階段在純培養(yǎng)的概念指導(dǎo)下發(fā)展起來的常規(guī)微生物學(xué)診斷技
術(shù)，主要包括病原體的顯
微鏡檢查、分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)鑒定、血清學(xué)反應(yīng)鑒定及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等技術(shù)。這些技術(shù)所需檢
樣量大，耗用藥品器械多，一般要數(shù)天才能出結(jié)果，因而不能滿足臨床診斷和治療的需要。
進(jìn)入本世紀(jì)以來，許多微生物學(xué)工作者試圖改變這種狀況，努力向簡單、快速的目標(biāo)邁進(jìn)，
取得了一些進(jìn)展，但始終擺脫不了純培養(yǎng)概念的束縛。
第二階段自本世紀(jì)七十年代以來，隨著物理學(xué)、化學(xué)和免疫學(xué)的
發(fā)展而建立起來的分析微
生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)，使微生物學(xué)診斷技術(shù)擺脫了純培養(yǎng)的概念，打破了常規(guī)微生物學(xué)
診斷的舊框框，繞過了繁瑣的純培養(yǎng)操作，直接對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測，在幾小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)
獲得結(jié)果，使微生物的快速診斷成為可能，達(dá)到對(duì)傳染病進(jìn)行早期診斷、治療效果評(píng)價(jià)及預(yù)
后判斷之目的。分析微生物學(xué)技術(shù)主要包括，氣相色譜技術(shù)、電阻抗測量技術(shù)、放射測量技
術(shù)和發(fā)光技術(shù)等。用于微生物快速診斷的免疫學(xué)技術(shù)常用的有免疫熒光技術(shù)、免疫酶聯(lián)技術(shù)
、放射免疫技術(shù)和對(duì)流免疫電泳技術(shù)等。
第三階段近十幾年來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展而建立起來的用于
檢測病原體核酸和蛋白質(zhì)
的分子生物學(xué)技術(shù)，如核酸探針診斷技術(shù)及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等，使病原體的鑒定不再局限
于其外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般性質(zhì)的檢驗(yàn)上，而是站在分子水平的高度，檢測病原體
內(nèi)部的生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸)結(jié)構(gòu)。這些新技術(shù)具有簡便、快速、微量、特異等優(yōu)點(diǎn)，
有著廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。
以下就API鑒定系統(tǒng)及分子生物學(xué)技術(shù)作一簡單介紹：
一API鑒定系統(tǒng)及其在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用
長期以來，我國臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室一直沿用100多年前由革蘭、巴斯德、科赫及皮特里等
創(chuàng)造的傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)鑒定方法。但在今天看來，傳統(tǒng)的鑒定方法不僅過程繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，
且在結(jié)果的判斷上易發(fā)生主觀片面，難以進(jìn)行質(zhì)量控制。隨著微生物感染類型的改變，新型
病原菌的種、屬不斷增加，因此，臨床上迫切需要建立快速、準(zhǔn)確的細(xì)菌鑒定方法。
本世紀(jì)70年代誕生的微生物數(shù)碼分類鑒定法集數(shù)學(xué)、電子、信息及自動(dòng)分析技術(shù)于一體，
可將已知菌科鑒定到屬、群、種和亞種或生物型，以根據(jù)不同來源的臨床標(biāo)本進(jìn)行有針對(duì)性
的鑒定。該法目前已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，具有標(biāo)準(zhǔn)化、商品化、簡易化、微量化、快速
化和系統(tǒng)化等優(yōu)點(diǎn)。
在眾多的細(xì)菌快速鑒定系統(tǒng)(API、Minitek、Enterotube、MicroID)之中，API(AnlyticP
roducts INc)系統(tǒng)是目前世界上應(yīng)用最廣、種類最多的系統(tǒng)。根據(jù)待鑒定的細(xì)菌種類的不同
，以及為滿足快速鑒定藥敏試驗(yàn)和研究工作的要求，API系統(tǒng)設(shè)計(jì)了不同的項(xiàng)目與底物組合
，可分為四類：
1快速鑒定系統(tǒng)；
2特定菌屬(群)的鑒定系統(tǒng)；
3ATB(Automatic Testing Bacteriology)系統(tǒng)；
4用于研究細(xì)菌對(duì)糖的發(fā)酵、氧化和同化能力以及細(xì)菌所具有的酶譜。
使用生化反應(yīng)譜索引時(shí)，必須先將生化反應(yīng)所得陽性或陰性結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)碼，并與索引手冊(cè)
中數(shù)碼相比較。
編碼的原則是將所有的20(或32)個(gè)生化反應(yīng)，加上接觸酶和3個(gè)形態(tài)特征，即是否產(chǎn)生芽胞
、革蘭氏染色和菌體形態(tài)是否球狀，從陽性到陰性的信息濃縮成一組數(shù)字。具體用法是每
三個(gè)反應(yīng)為一組，每組內(nèi)按其位置，第一位陽性為1，第二位陽性為2，第三位陽性為
4，陰性反應(yīng)時(shí)均為0，每個(gè)組內(nèi)數(shù)之和就可能為0、1、2、3、4、5、6、7。如此可將API系
列試驗(yàn)條測定，組成一個(gè)八位或十位的數(shù)字。其數(shù)值舉例如下：
靛尿葡
基萄
質(zhì)素糖〖〗甘乳蔗露醇糖糖〖〗麥水木芽楊糖素糖〖〗阿明七拉
伯葉糖膠靈〖〗甘纖甘維二露油糖糖〖〗松棉山三子梨
糖糖醇〖〗鼠海觸李藻糖糖酶〖〗芽革細(xì)蘭胞氏形染胞色態(tài)
①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④
- - +〖〗+ - -〖〗- - -〖〗- + -〖〗- + +〖〗+ - -〖〗- - -〖〗+ + -
〖〗〖〗〖〗〖〗〖〗
〖〗〖〗
4〖〗1〖〗0〖〗2〖〗6〖〗1〖〗0〖〗3
這株菌的數(shù)值編碼為41026103，根據(jù)數(shù)值編碼檢索，即可查出此菌的菌
屬和菌種名稱，該菌為艱難梭菌。
從數(shù)值編碼檢索表中查出哪類群菌屬種名稱，同時(shí)根據(jù)鑒定概率(%id)對(duì)鑒定的可信度作出
評(píng)價(jià)：
%id≥99.9最佳的鑒定可信
%id99.0～99.8很好的鑒定
%id90.0～98.9好的鑒定
%id80.0～89.9可接受的鑒定
如果%id過低時(shí)，應(yīng)按補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定。從數(shù)值編碼檢索表中查不出類群，可以考慮以
下可能：①編碼的菌是極不典型的；②概率小，不能接受的鑒定；③可疑的鑒定或新種。
API試劑條由高質(zhì)量透明塑料制成，便于觀察結(jié)果，有20個(gè)小管式反應(yīng)杯，內(nèi)含干燥生化基
質(zhì)液，常用的生化反應(yīng)有五類：
1.發(fā)酵試驗(yàn)為碳水化合物與酸的分解代謝試驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)果通過pH
值的變化而引起指示劑顏色的改變。
2.同化試驗(yàn)將待測菌分別培養(yǎng)于含各種基質(zhì)的培養(yǎng)基中，根據(jù)其
能否利用其中的單一碳水化合物作為碳源而得以生長以幫助鑒定，是一種生長試驗(yàn)。
3.同化或發(fā)酵抑制試驗(yàn)為生長抑制試驗(yàn)，待測菌如遇到對(duì)其有毒
的化合物就不能生長或不出現(xiàn)相應(yīng)的反應(yīng)，據(jù)此可幫助鑒定。
4.酶試驗(yàn)為分解某些合成底物的化學(xué)反應(yīng)，如待測菌含有相應(yīng)的
酶就可分解底物自發(fā)顯色或經(jīng)添加試劑后顯色。
操作程序分準(zhǔn)備、接種、觀察并記錄結(jié)果三個(gè)階段。
一、準(zhǔn)備
1.標(biāo)本處理必要時(shí)使用運(yùn)送培養(yǎng)基及進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)等。
2.預(yù)試驗(yàn)如革蘭氏染色、鏡檢等。
3.菌落的選擇挑選可疑致病菌的特征性菌落。
二、接種
1.制備細(xì)菌懸液挑取1個(gè)或多個(gè)菌落按不同要求用蒸餾水或生理鹽水制備細(xì)菌懸液。
2.接種的濃度根據(jù)試劑條的要求制備約1.5億/ml的細(xì)菌懸液。
3.接種的體積有以下三種要求：(1)試驗(yàn)名稱下無任何標(biāo)記的小孔，加入細(xì)菌懸液至“半
滿”，小管滿而小杯空。(2)如試驗(yàn)名稱加有方框，則加菌液至平滿，小管和小杯皆滿。(3)
如試驗(yàn)名稱下有一條橫線，表示需加液體石蠟，應(yīng)加菌液至半滿后在小杯內(nèi)加液體石蠟。
三、觀察及記錄結(jié)果
接種后的API試條一般經(jīng)35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)可觀察結(jié)果。觀察方法有三種(見下表)：
1.自發(fā)反應(yīng)可用肉眼直接觀察顏色變化，多數(shù)試驗(yàn)屬于此種；
2.需添加試劑的反應(yīng)有些試驗(yàn)需添加不同的試劑后方出現(xiàn)顏色變化；
3.熒光反應(yīng)有些試驗(yàn)需在紫外燈下觀察熒光現(xiàn)象。
API20A生化反應(yīng)表
測定〖〗底物〖〗反應(yīng)/酶〖〗結(jié)果陰性〖〗陽性
Ind〖〗色氨酸〖〗吲哚產(chǎn)生〖〗加1滴二甲
苯到石蠟中混和，待2～3分鐘，再加入1滴Ehr試劑。試驗(yàn)必需浮在二甲苯/石蠟油上。5分鐘
之內(nèi)讀結(jié)果黃色〖〗紅色
Ure〖〗尿素〖〗尿素酶〖〗黃—橙色〖〗紅色
Glu〖〗葡萄糖〖〗〖〗溴甲酚紫
Man〖〗甘露醇
Lac〖〗乳糖
Sac〖〗蔗糖〖〗產(chǎn)酸〖〗紫色〖〗黃綠—黃色
Mal〖〗麥芽糖
Sal〖〗水楊素
Xyl〖〗木糖
Ara〖〗阿拉伯糖
Gel〖〗明膠〖〗水解(蛋白酶)〖〗無色素?cái)U(kuò)散〖〗有色素?cái)U(kuò)散
Esc〖〗七葉靈〖〗水解(β葡萄糖甙酶)〖〗紫外燈(365nm)黃色—熒光
〖
〗棕黑—無熒光
Gly〖〗甘油〖〗〖〗溴甲酚紫
Cel〖〗纖維二糖
Mne〖〗甘露糖
Mlz〖〗松三糖
Raf〖〗棉子糖〖〗產(chǎn)酸〖〗紫色〖〗黃綠—黃色
Sor〖〗山梨醇
Rha〖〗鼠李糖
Tre〖〗海藻糖
Gat〖〗〖〗觸酶〖〗加2滴過氧化氫于甘露醇管，在空氣中30分鐘后〖〗〖〗〖〗無氣泡〖〗有氣泡
Spor〖〗〖〗芽胞〖〗無〖〗有
Gram〖〗〖〗革蘭氏染色〖〗紅色(陰性)〖〗紫色(陽性)
Cocc〖〗〖〗菌體形態(tài)〖〗桿狀〖〗球狀
觀察后判斷“+”及“-”并在報(bào)告單上記錄結(jié)果，同化試驗(yàn)觀察以有無細(xì)菌生長(混濁)作為
陽性/陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
二分子生物學(xué)技術(shù)
近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和各項(xiàng)新技術(shù)的廣泛應(yīng)用，有關(guān)微生物種屬間親緣關(guān)系
的分類鑒定工作，正從一般表型特征的鑒定深化為遺傳特征的鑒定，技術(shù)上也從一般形態(tài)、
生理生化、血清學(xué)試驗(yàn)等提高到分子水平。目前用于微生物分類鑒定的分子生物學(xué)方法有：
DNA中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)摩爾百分比(mol%)的測定、核酸分子雜交和PCR技術(shù)等。
1、細(xì)菌的DNAG+Cmol%的測定
G+Cmol%作為鑒別細(xì)菌種屬間親疏關(guān)系的一個(gè)重要遺傳型特征，在細(xì)菌分類鑒定中的作用已
被公認(rèn)，它有助于對(duì)表型(如形態(tài)、抗原抗體反應(yīng)和理化特征)上難以區(qū)分的細(xì)菌作分類鑒定
，使分類鑒定依據(jù)由表現(xiàn)型向遺傳型特征深化，并有助于分子水平上探索生物進(jìn)化的親緣關(guān)
系。
不同細(xì)菌DNA中的G+Cmol%是不同的，變化幅度寬(30～75%)，但同種細(xì)菌的G+Cmol%比較穩(wěn)定
，不受菌齡影響，也不受突變因素之外的生長條件等各種外界因素的影響，所以G+Cmol%用
于細(xì)菌分類鑒定極有重要意義。
①G+Cmol%含量不同52667788.cn的細(xì)菌，肯定是不同種的細(xì)菌；G+Cmol%含量相同的細(xì)菌，可能是相近的
種屬，但也可能是不相同的細(xì)菌，需通過核酸雜交技術(shù)和表型特性確定。
②兩株細(xì)菌的G+Cmol%含量差別在2%以內(nèi)無意義；若差別有4～5%，可認(rèn)為是同種內(nèi)的不同菌
株；若差別在10～15%，可認(rèn)為是不同屬，甚至是不同科的細(xì)菌。
2、DNA限制性核酸內(nèi)切酶圖譜(指紋圖)分析
限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別和切割雙鏈DNA的特異部位，產(chǎn)生大小不同的片段，經(jīng)凝膠電泳后
在凝膠上形成獨(dú)特的DNA片段帶譜。利用薄層掃描儀和計(jì)算機(jī)，比較不同微生物DNA的特征性
指紋，可以了解它們的同源程度。
如將核酸標(biāo)記同位素后再行切割和電泳，通過放射自顯影，就可在底片上出現(xiàn)不同的斑點(diǎn)，
構(gòu)成指紋圖，從而對(duì)病原體基因組的異同進(jìn)行分析，最后做出鑒定。
因此，限制性核酸內(nèi)切酶分析是一個(gè)重復(fù)性、穩(wěn)定性、敏感性均很好的方法，可快速得到結(jié)
果，已成功地應(yīng)用于病毒和細(xì)菌的鑒定分型。
3、核酸探針診斷技術(shù)
不同的生物體具有不同的DNA序列，同種生物體含有相同的DNA序列，并且核苷酸序列是相對(duì)
穩(wěn)定的。DNA分子在一定條件下，可以解鏈成兩條單鏈分子。因此，可以利用核苷酸序列互
補(bǔ)的原理，用特異的核酸探針，通過核酸雜交來檢測和鑒定微生物。
核酸探針是指能識(shí)別特異堿基序列的，帶有標(biāo)記的一段單鏈DNA或RNA分子，也可以說是一段
與被測定的核苷酸序列(靶序列)互補(bǔ)的、帶標(biāo)記的單鏈核苷酸。標(biāo)記物通常有放射性同位素
、生物素、地高辛等。常用的核酸探針技術(shù)有如下幾種：
①斑點(diǎn)雜交法將待測的核酸直接點(diǎn)在硝酸纖維膜上，經(jīng)加熱或堿處理，使雙鏈的DNA或RN
R解鏈，變成單鏈，然后用已知的探針進(jìn)行雜交。如果待檢的DNA與探針DNA是變性同源的，
便會(huì)按配對(duì)原則，復(fù)性成雙鏈，將探針固定在濾膜上。最后根據(jù)標(biāo)記方法的不同，進(jìn)行不同
手段的檢測。
②Southern印跡法DNA經(jīng)內(nèi)切酶切割、瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上
，再與標(biāo)記的探針雜交及檢測。
③Northern印跡法是將RNA混合物經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到DBM纖維素膜上，再與標(biāo)記的
探針進(jìn)行雜交和檢測。
④原位雜交是用標(biāo)記的核酸探針直接與組織切片的細(xì)胞或菌落進(jìn)行特異的DNA或RNA雜交。
此法可保持細(xì)胞的基本形態(tài)，在完整的細(xì)胞上進(jìn)行核酸雜交反應(yīng)，有利于細(xì)胞內(nèi)基因定位和
檢測基因表達(dá)。
目前，核酸探針技術(shù)主要用于痢疾桿菌、霍亂弧菌、EB病毒、乙型肝炎病毒和艾滋病毒等常
規(guī)診斷。由于此法快速、簡便、特異，且敏感性可達(dá)1～10pg的DNA水平，所以在快速診斷領(lǐng)
域中是主要競爭者，對(duì)于不易分離培養(yǎng)或大量培養(yǎng)增殖后有危險(xiǎn)性的微生物標(biāo)本，用核酸探
針技術(shù)進(jìn)行檢測更有著特殊的優(yōu)越性。
4、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
聚合酶鏈反應(yīng)又稱“體外基因擴(kuò)增”，是1985年由美國MullisKB等人首創(chuàng)的一項(xiàng)新技術(shù)，具
有快速、簡便、靈敏、特異等特點(diǎn)，可在短短的幾小時(shí)內(nèi)將pg水平DNA中特定序列的單個(gè)拷
貝擴(kuò)增到百萬倍，從而為基因的檢測工作提供了大量的基因材料。PCR已廣泛應(yīng)用于病原微
生物的檢測、遺傳性疾病的診斷等領(lǐng)域。
PCR原理是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，在試管內(nèi)模仿體內(nèi)DNA的復(fù)制，使復(fù)制過程
限定在一對(duì)人工外源加入的“引物”之間進(jìn)行。這對(duì)引物是依據(jù)被擴(kuò)增區(qū)DNA片段的兩側(cè)邊
界DNA序列人工合成的，通常為20bp左右，每一引物與相對(duì)應(yīng)的一條DNA鏈互補(bǔ)。人工合成的
兩個(gè)引物決定了擴(kuò)增DNA序列的特異性。PCR反應(yīng)包括下述三個(gè)步驟：
①變性(denature)經(jīng)加熱后，DNA雙鏈解離形成兩條單鏈。
②退火(anneal)當(dāng)反應(yīng)溫度降低時(shí)，兩個(gè)引物分別結(jié)合到靶DNA的兩個(gè)單鏈的3′末端。
③延伸(extension)在四種脫氧三磷酸核苷存在的條件下，由TaqDNA多聚酶催化，使引物
沿著模板DN
A的3′→5′方向延伸，以靶DNA鏈為模板合成一條新的雙鏈DNA。新合成的DNA鏈經(jīng)變性解離
后，又可作為模板，與剩余的引物結(jié)合，并在DNA聚合酶的催化下再次延伸，合成新的DNA鏈
。如此反復(fù)進(jìn)行上述三個(gè)步驟，可使靶DNA片段呈指數(shù)性擴(kuò)增。經(jīng)20～40個(gè)循環(huán)，在
短短的幾小時(shí)內(nèi)，DNA序列可擴(kuò)增百萬倍。由于PCR的放大作用本身具有特異性，故擴(kuò)增后的
DNA只要用電泳或簡單的非同位素標(biāo)記的探針即可檢測出來，易于在臨床推廣應(yīng)用。
目前，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種病原體的檢測，用于發(fā)現(xiàn)一些不易分離培養(yǎng)的病原體，檢
測一些不易獲得的少量標(biāo)本，如人體活檢組織；或病原體含量較少的標(biāo)本，如食器飲水標(biāo)本
；還可用來研究腫瘤病毒在細(xì)胞基因整合狀態(tài)和位置，用于研究病毒與腫瘤的關(guān)系等。隨著
PCR技術(shù)的進(jìn)一步完善，尤其是自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn)，必將給微生物診斷技術(shù)帶來巨大的推動(dòng)。
(龍北國張文炳趙衛(wèi)羅軍)
