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| 實驗二十二 標準曲線的制作及回收試驗 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
【實驗目的】 在生物化學與分子生物學實驗過程中，常常需要對生物樣品中某種物質的含量進行測定。通過制作待測物質在一定測定條件下的標準曲線，可十分方便快捷地進行樣品中物質含量的大批量測定。同時，為了了解生物樣品中其他物質對測定結果的影響，可通過回收試驗來判斷。本實驗以鄰甲苯胺法測定血液樣品中葡萄糖含量為例，通過糖標準曲線的制作及回收試驗的操作，綜合性訓練學生掌握標準曲線的制作以及對大批量生物樣品中物質含量進行準確測定的技術方法。 【實驗原理】 1. 標準曲線的制作原理 配制一系列已知不同濃度的測定物標準溶液，按樣品測定同樣的方法處理顯色，分別測得它們的光密度，再以光密度為縱坐標，濃度為橫坐標，在方格坐標紙上作圖，所得的曲線即標準曲線。 制作標準曲線的意義在于：①作為較正曲線，從濃度-光密度的直線特性，可判斷某一測定方法中化學反應產(chǎn)生的顏色物質是否符合52667788.cn/wszg/或遵守Lambert-Beer定律。②可判斷在操作過程中，操作、儀器等誤差的大小，從而確定方法的可靠性。③作為工作曲線，在大量進行樣品中測定物含量分析時，通常用作計算的基礎，即從曲線上可直接找到測定液的光密度所相當?shù)臐舛取?/p> 2. 回收試驗原理 在分光光度測定法中，測定液除含待測物質外，還含有許多非測定成份而與標準液的測定結果不一致。這些成份是否影響顯色反應并引起測定誤差，可借回收試驗來檢查。即在待測樣品中加入已知濃度的標準物質，再按樣品測定的條件和方法進行顯色及測定，然后計算所測出的標準物質的含量占加入標準物質量的百分率，這種操作稱為回收試驗，以回收率(%)表示。 回收率愈接近100%，說明樣品中非測定成份對測定結果的影響愈小，結果愈準確可靠�；厥章室嗫煞从掣蓴_物質存在與否、影響程度如何以及這種影響與濃度有無關系；還可檢查操作誤差和儀器誤差。一般認為回收率達到100±5%即較為理想。 3. 血糖含量測定（鄰甲苯胺法)原理 葡萄糖在熱醋酸溶液中與鄰甲苯胺（ortho-toluidine)縮合生成藍綠色的希夫堿（Schiff base)，其顏色深淺與葡萄糖含量成正比；與同樣處理的葡萄糖標準溶液進行分光光度測定（或根據(jù)其光密度查標準曲線)，可求得待測血液樣品中葡萄糖的含量。正常人血糖含量為3.89~5.56 mmol/L。 4. 臨床意義 血糖超過正常最高值，稱為高血糖癥，常由糖尿病、甲狀腺機能亢進、腦垂體前葉機能亢進、腎上腺皮質和髓質機能亢進等疾病引起。血糖低于正常最低值，稱為低血糖癥，多見于胰島素分泌過多、腎上腺皮質機能減退、腦垂體前葉機能減退、甲狀腺機能減退等。
【實驗試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 鄰甲苯胺試劑：稱取硫脲（thiourea，A.R.)2.5 g，溶于冰乙酸（glacial acetic acid，A.R.)750 mL中。將此溶液轉移入1 L容量瓶內，加鄰甲苯胺（ortho-toluidine)150 mL, 2.4% 硼酸（boric acid)溶液100 mL，再加冰乙酸至1 L刻度，置棕色瓶中，至少可應用兩個月。 ⑵ 葡萄糖貯存標準液（50mmol/L)：將少量無水葡萄糖（A.R.或C.P.)置于硫酸干燥器內一夜。精確稱取此葡萄糖0.900 g，以飽和苯甲酸溶液溶解并轉移入100 mL容量瓶內，再以飽和苯甲酸溶液稀釋至100 mL刻度。置冰箱中可長期保存。 ⑶ 葡萄糖應用標準液（1.25mmol/L)：準確吸取葡萄糖貯存標準液2.5 mL，置100 mL容量瓶內，以飽和苯甲酸溶液稀釋置100 mL刻度。 ⑷ 飽和苯甲酸溶液：稱取苯甲酸（benzoic acid)2.5 g，加入蒸餾水1 L中，煮沸使溶解，冷后貯存于試劑瓶中。 2. 器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 刻度吸量管。 ⑶ 水浴鍋。 ⑷ 722型分光光度計。 ⑸ 方格坐標紙。 【實驗步驟】 1. 操作 取潔凈干燥的試管8支，編號，按下表操作：
混勻后置沸水浴中加熱15分鐘。取出，用冷水冷卻；用波長630nm進行比色，以空白管校正光密度到零點，讀取各管光密度，并記錄之。 2. 結果與計算 ⑴ 計算：列公式并計算出測定管的葡萄糖含量（選擇與測定管光密度值接近的標準管進行計算)，單位為mmol/L。 ⑵ 作圖：將以上各標準管光密度為縱坐標，相應的各標準管葡萄糖濃度（依次相當于1.25mmol/L，2.5mmol/L，3.75mmol/L，5.0mmol/L，6.25mmol/L)為橫坐標，在坐標紙上作圖，繪成標準曲線。 ⑶ 從標準曲線上查出血清葡萄糖含量，并與計算的結果進行比較。 ⑷ 回收率計算：列公式并計算回收管的葡萄糖含量（選擇與回收管光密度值較接近的標準管光密度值進行計算)，單位為mmol/L。 回收率(%) = 回收量(mmol/L)/加入量(mmol/L) × 100% 注：回收量(mmol/L)= 回收管葡萄糖含量(mmol/L)－ 測定管葡萄糖(mmol/L) 本實驗中加入量為2.5 mmol/L。 【實驗注意事項】 1. 在保證取量準確的前提下，所使用的不同規(guī)格的吸量管或移液器應盡可能少。 2. 為保證測定值的精確性，可設定平行管并取平均值。 【思考題】 1. 如何制作標準曲線？制作標準曲線時有哪些注意事項？標準曲線的何用途？ 2. 為什么要進行回收試驗？其原理是什么？ 3. 怎樣計算回收率？ 4. 鄰甲苯胺法測定血糖的原理是什么？ 5. 血糖的正常值是多少？有何臨床意義？
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