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| 實驗十二 組織細胞基因組DNA的提取 |
【實驗?zāi)康摹?/p> 生物細胞DNA提取方法較多，本實驗熟悉生物細胞DNA提取方法的一種；掌握SDS使蛋白質(zhì)變性而與DNA分離進行提取DNA的基本原理；熟悉SDS法提取DNA的基本操作過程。 【實驗原理】 生物組織中DNA是以DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在。在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白質(zhì)溶解度小，RNA-蛋白質(zhì)溶解度大；在濃NaCl溶液中，DNA-蛋白質(zhì)溶解度大，RNA-蛋白質(zhì)溶解度��；據(jù)此可分開DNA和RNA。 SDS（十二烷基硫酸鈉)，是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)的疏水部位，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)變性并與DNA分離；SDS也是一種良好的解離劑，可使蛋白質(zhì)溶解，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并使復(fù)合物帶負電。 氯仿-異丙醇可以將蛋白質(zhì)除去，離心后形成三層，上層為DNA、異丙醇和水；中層為蛋白質(zhì)沉淀；下層為氯仿。適量的冷無水乙醇可使DNA沉淀析出。加入EDTA - 2Na（乙二胺四乙酸二鈉)可防止DNA酶的降解。 A260/A280比值可用于檢查DNA純度：A260/A280 ＝1.8，高純度DNA；A260/A280< 1.8，含蛋白質(zhì)； A260/A280> 1.8，含RNA。 【實驗試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA。 ⑵ 5 mol/L NaCl。 ⑶ 30% SDS。 ⑷ 氯仿-異丙醇混合液。 ⑸ 0.015mol/L NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉。 ⑹ 冷無水乙醇。 2. 器材 ⑴ 低速離心機。 ⑵ 鑷子。 ⑶ 剪刀。 ⑷ 三角燒瓶。 【實驗步驟】 1. 提取脫氧核糖核蛋白 ⑴ 取兔肝3克（2~3只小鼠)，15 mL 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA洗去血液。 ⑵肝勻漿制備：將兔肝置乳缽中剪碎，加15 mL 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA研磨勻漿，注意不要用力研磨。 ⑶ 3000 rpm離心10分鐘，棄上清；沉淀加入0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA 15 mL輕輕混懸。 ⑷ 3000 rpm離心 10分鐘，棄上清；沉淀加入0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA 10 mL 使之溶解，轉(zhuǎn)至50毫升三角燒瓶中。 2. 去除蛋白質(zhì) ⑴ 加入30% SDS 1 mL 混勻，60℃水浴輕搖15分鐘，取出冷至室溫。 ⑵加入5 mol/L NaCl2.75 mL，輕搖10分鐘。 ⑶加入氯仿-異丙醇19 mL（沉淀蛋白)，輕搖20分鐘，離心 25052667788.cn/sanji/0rpm10分鐘。 3. 提取DNA ⑴ 吸上清（水相)轉(zhuǎn)入玻璃離心管（含DNA)，棄沉淀（剩余物)。 ⑵加入1.5倍體積冰乙醇（無水乙醇)輕搖至DNA析出。 4. 檢測 ⑴ 用鑷子或玻璃棒取出置試管中，加入0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉1mL。 ⑵ 量取10~50 μL(用0.1 mL刻度吸管吸取) 原液，用0.015mol/L NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉稀釋到5 mL（稀釋100~500倍)。 ⑶ 測A260/A280（用0.015 mol/L NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉做空白溶液)。 5. 計算 ⑴ DNA濃度：（μg/mL)=A260×50×稀釋倍數(shù) ⑵ DNA純度：A260/A280 【實驗注意事項】 1．為盡可能避免DNA 大分子的斷裂，在實驗過程中必須注意：① 研磨時上下用力，應(yīng)保持低溫，研磨時間應(yīng)短，勿用玻璃勻漿器。② 實驗中使用的吸取DNA 水溶液的滴管管口需粗而短，并燒成鈍口。③ 抽提時勿劇烈振搖。 2．保醫(yī)學(xué)全.在線持DNA 活性，避免酸、堿或其它變性因素使DNA 變性。 3．加入氯仿—異丙醇后勿劇烈搖動，以免大分子斷裂。 4．有機溶劑對人體有害，操作時要注意。 【思考題】 1．如樣品中有蛋白質(zhì)存在，其紫外分析結(jié)果有何表現(xiàn)?如何進一步純化？ 2．DNA 的定量可采用那些方法?目前常用的是哪種?如何測定DNA 的含量？ 3．從生物細胞中提取DNA 的主要注意點是什么?應(yīng)如何控制？ 4．能引起DNA 變性的因素有哪些？DNA 降解和DNA 變性有何區(qū)別？如何鑒別？
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