實(shí)習(xí)五、總抗壞血酸測定（2，4-二硝基苯肼比色法)
（一)目的意義
食品中的總抗壞血酸包括還原型和脫氫型兩種形式。當(dāng)食物陳舊、儲存日久以及經(jīng)過烹調(diào)處理的食物，其中有相當(dāng)一部分抗壞血酸成為脫氫型，此種形式的抗壞血酸仍有85%左右維生素C活性，因此對這類食物常常測定總抗壞血酸。
（二)原理
樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫型抗壞血酸。在一定條件下，脫氫型抗壞血酸與2，4-二硝基苯肼作用生成紅色的脎，脎的生成量與總抗壞血酸含量成正比，將脎溶解在硫酸中后可進(jìn)行比色定量。
（三)儀器和試劑
1．恒溫水浴37±0.5℃。
2．可見紫外分光光度計。
3．搗碎機(jī)。
4. 4.5mol/L硫酸250ml濃硫酸（比重1.84)緩慢地加入700ml蒸餾水，冷卻后用水稀釋至1000ml。
5. 85%硫酸 850ml濃硫酸（比重1.84)緩慢加入150ml水中。
6. 2%2，4-二硝基苯肼溶液 溶解2g2，4-二硝基苯肼于100ml 9mol/L硫酸
內(nèi)，過濾。不用時存于冰箱，每次用前必須過濾。
7. 2%草酸溶液。
8. 1%硫脲 稱取5g硫脲溶解在500mll%草酸溶液中。
9. 2%硫脲 稱取10g硫脲溶解在500mll%草酸溶液中。
10. 活性炭 加200g碳粉于1L鹽酸溶液（1分鹽酸+9分水)，加熱回流1~2小時，過濾，用水洗至濾液中無鐵離子為止，置于110~1200C烘箱中干燥，備用。
11.抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1mg/ml) 稱取100mg純抗壞血酸溶解于100ml l%草酸中。
（四)操作步驟
1．樣品提取 均勻取樣100g，剪碎置搗碎機(jī)中，加100ml 2%草酸，制成勻漿。取10～40g勻漿（含1～2mg抗壞血酸)倒入容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。過濾，濾液備用。
2．氧化 取上述濾液2.5ml加入2g活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10ml濾液，加入10ml 2%硫脲溶液，混勻，備用。
3．脎的形成 取3個試管A為空白管，B、C為樣品管。三管中各加入4ml上述氧化后的樣品液，B、C管中再各加入l.Oml 2%2，4-二硝基苯肼溶液。將所有試管放入37±0.5℃恒溫水浴保溫3h。取出置室溫下，A管加2% 2，4-二硝基苯肼溶液l.Oml，放置1052667788.cn/sanji/～15min。
4．脎的溶解 各管置冰浴中緩慢加入85%硫酸5ml，滴加時間至少需1min，需邊加邊搖動試管。取出試管，室溫下放置30min后比色。
5．比色用1cm比色杯，以空白液調(diào)零點(diǎn)，于540nm波長測吸光度。
6．標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取50ml標(biāo)準(zhǔn)液于錐形瓶中，加2g活性炭，振搖1min，過濾，取濾液10ml于500ml容量瓶中，加5.Og硫脲，用1%草酸溶液稀釋至刻度，抗壞血酸濃度為20μg/ml。取5、10、20、25、40、50、60ml稀釋液，分別放入7個100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1、2、4、5、8、10、12μg/ml。按樣品測定步驟形成脎并比色，以吸光值為縱坐標(biāo)，以抗壞血酸濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（五)計算
抗壞血酸含量
式中 C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得“樣品氧化液”中抗壞血酸濃度，μg/ml。
V:試樣用1%國家醫(yī)學(xué)考試網(wǎng)草酸溶液定容的體積，ml。
F:樣品氧化過程中的稀釋倍數(shù)。
W:樣品重量，g。
（六)說明
1．加85%硫酸溶解形成的脎時應(yīng)邊加邊振搖試管，以防樣品中糖碳化而使溶液變黑。
2．加入硫酸30min后必須立刻比色，因?yàn)轭伾珪^續(xù)加深。
3．硫脲可防止抗壞血酸被氧化，并有助于脎的形成。
（七)思考題
100g樣品加2%草酸制成勻漿，取10g勻漿用1%草酸稀釋至100ml過濾，取25ml濾液氧化后過濾，再取10ml氧化后濾液加10ml 2%硫脲溶液稀釋，取4ml稀釋液進(jìn)行測定。測得值查標(biāo)準(zhǔn)曲線算得抗壞血酸濃度為9μg/ml，求樣品中抗壞血酸含量。
