一、直接診斷和間接診斷
基因診斷可分為兩類：一類是直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因無(wú)突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾�。涣硪活愂腔蜷g接診斷。當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時(shí)，或致病基因本身尚屬未知時(shí)，也可以通過對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標(biāo)記通常一起傳給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，可以間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。
二、基因異常與診斷方法的選用
各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。后者包括單個(gè)堿基置換、微小缺失或插入。近年來不發(fā)現(xiàn)一些遺傳病是由于基因內(nèi)的三核苷酸重復(fù)順序增加引起的，根據(jù)對(duì)基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法（表13－2)。如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴(kuò)增直接檢測(cè)；點(diǎn)突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢查。一般無(wú)需對(duì)家系成員進(jìn)行分析。但條件是必需知道基因異常的性質(zhì)，并肯定該異常與疾病之間的關(guān)系。然而，由于許多疾病的遺傳異質(zhì)性，以及多數(shù)遺傳的基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。
表13－2 遺傳的基因診斷方法
| 基因異常 | 方法 | 探針、引物或限制酶 |
| 基因缺失 | 基因組DNA印跡雜交
PCR擴(kuò)增 |
缺失基因的探針
引物包括缺失或在缺失部位內(nèi) |
| 點(diǎn)突變 | RFLP分析
ASO雜交 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析 （RFLP、SSCP、DGGE) |
突變導(dǎo)致其切點(diǎn)消失的限制酶
正常和異常的ASO探針 引物包括突變部位 |
| 基因已知但異常不明 | 基因內(nèi)或旁側(cè)序列多態(tài)性（RFLP、AMP－FLP，SSCP)連鎖分析 | 基因內(nèi)或旁側(cè)序列探針或引物 |
| 基因未知 | 與疾病連鎖的多態(tài)性，如SSCP、AMP－FLP連鎖分析，RFLP位點(diǎn)單體型連鎖分析 | 與疾病連鎖的多態(tài)位點(diǎn)探針或引物 |
許多遺傳病的基因尚未分離克隆，或基因異常尚不清楚，因此還不能根據(jù)突變的性質(zhì)進(jìn)行診斷。但如果通過家系分析能證明某一DNA標(biāo)記（無(wú)論是等位基因還是多態(tài)性位點(diǎn)或片段)與致病基因連鎖，則凡帶有該標(biāo)記的成員都可能帶有致病基因，從而可作出間接的連鎖分析診斷。
應(yīng)用連鎖分析診斷時(shí)應(yīng)注意如下幾個(gè)問題：①基因與DNA標(biāo)記之間可能發(fā)生重組。因此連鎖分析的準(zhǔn)確性取決于DNA與致病基因連鎖的緊密程度，連鎖愈緊密，可靠性愈高，故應(yīng)采用盡量靠近致病基因，即連鎖緊密的標(biāo)記，或采用多個(gè)遺傳標(biāo)記以盡可能排除重組。由于可能存在重組，連鎖分析不能完全確定致病基因是否存在，而是指出存在可能性或概率的大小。如果標(biāo)記距基因有5cM，即重組率為5％，則作出診斷時(shí)尚有5％誤差的可能，即只有95％的把握作出肯定或否定的結(jié)論。②選用的遺傳標(biāo)記在人群中的雜合度。如果標(biāo)記的雜合度在人群中很低，即多數(shù)個(gè)體為純合子，則這種標(biāo)記用處不大。因?yàn)槿缂蚁抵嘘P(guān)鍵成員不能提供致病基因在哪一條染色體上的信息，常使連鎖分析無(wú)法進(jìn)行，因此需選用人群中雜合度高的標(biāo)記。③在連鎖分析時(shí)，有時(shí)只分析一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)還不能把某一家系中帶有致病基因的染色體與正常染色體區(qū)分開來。這通常是由于關(guān)鍵成員如待診者的父母是純合子，不能提供必要的信息，這時(shí)可同時(shí)分析更多的多態(tài)位點(diǎn)，即作單倍型（haplotype)分析。單倍型是指一條染色體上兩個(gè)或兩個(gè)以上多態(tài)位點(diǎn)的狀態(tài)的組合。兩條染色體多個(gè)位點(diǎn)上都純合的概率畢竟是很小的，因此單倍型有助于區(qū)分兩條常染色體，并追蹤致病基因的分離情況。
三、遺傳病的基因診斷舉例
1．基因缺失型遺傳的診斷
（1)α地貧的基因診斷：α地貧主要是由于基因缺失引起的，缺失的基因可以由1－4個(gè)。正�；蚪M用BamHⅠ切割，可以得到一個(gè)14kb的片段，而缺失一個(gè)α基因時(shí)切點(diǎn)向5’端移位，得到一條10kb的片段。因此，當(dāng)用α基因探針與基因組DNA進(jìn)行Southern雜交時(shí)（圖13－8)，在α地貧2可見一條14kb和一條10kb的帶，在正常人可見一條雙份的14kb的帶，而在α地貧1則見一條單拷貝的14kb帶，血紅蛋白H病時(shí)只有一條10kb的帶的，而在Barts水腫胎時(shí)，則無(wú)任何雜交帶。
圖13－8 α地貧基因缺失的診斷
左圖：16號(hào)染色體上攜有數(shù)目不同的基因
右圖：α基因探針雜交的結(jié)果
箭頭：BamHⅠ切點(diǎn)
一種較簡(jiǎn)便的方法是直接用α探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，自顯影后根據(jù)斑點(diǎn)深淺的不同也可以對(duì)α地貧作出診斷。更為簡(jiǎn)單的方法是PCR診斷，即在α基因缺失范圍內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，然后PCR擴(kuò)增胎兒的DNA，如為Barts 水腫胎，則無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳后無(wú)任何帶紋，從而可建議進(jìn)行人工流產(chǎn)，但此法不能診斷其它類型的地貧（除非另設(shè)計(jì)引物用作PCR)。
（2)DMD／BMD的缺失型診斷：DMD／BMD是一種Ⅹ連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)受累的致死性遺傳�。▍㈤喌谒恼�)。DMD／BMD有70％左右為缺失型。此基因很大，缺失可發(fā)生在不同部位，因此應(yīng)盡可能采用多對(duì)引物作PCR擴(kuò)增（多重PCR)來檢測(cè)。如擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)有帶紋的缺失，即可作出診斷并對(duì)缺失定位（圖13－9)，在進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)，一般可先通過檢測(cè)家系中有關(guān)成員，即確定先證者的缺失區(qū)，然后有針對(duì)性地作PCR擴(kuò)增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關(guān)患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。
2．點(diǎn)突變型遺傳病的基因診斷2
�。�1)鐮形細(xì)胞性貧血的基因診斷：已知突變基因是編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變?yōu)镚TG，從而使纈氨酸取代了甘氨酸，因此可用如下方法進(jìn)行診斷。
圖13－9 DMD基因缺失的多重PCR診斷
exon：外顯子；pm:啟動(dòng)子；1：正常9條帶；2：基因全缺失；3：?jiǎn)?dòng)子區(qū)缺失；4：第3外顯了缺失；5：第13外顯子缺失；6：第47外顯子缺失；7：47－52外顯子區(qū)段缺失；8：第52外顯子缺失
1)RFLP診斷：已知限制酶MstⅡ切割的識(shí)別順序是CCTNAGG，它能切割正常β鏈中CCTGAGG序列，但不能切割突變了的CCTGTGG（A→T)。這樣，由于突變消除了一個(gè)切點(diǎn)，使內(nèi)切酶長(zhǎng)度片段發(fā)生了改變，通過電泳，就可以區(qū)別正常的βA和βS（圖13－10)。
圖13－10 鐮狀貧血的基因診斷
除MstⅡ外，限制酶DdeⅠ（識(shí)別序列為CTNAG)也能夠把正常的βA基因與鐮變了的βS基因區(qū)別開來，并用于診斷。
2)ASO探針診斷：由于突變部位和性質(zhì)已完全明了，也可以合成寡核苷酸探針，用32P標(biāo)化來進(jìn)行診斷。此時(shí)需要合成兩種探針，一種與正常βA基因序列完全一致，能與之穩(wěn)定地雜交；另一種與突變基因序列一致，能與βS基因穩(wěn)定雜交，但不能與正常的βA基因雜交。根據(jù)雜交結(jié)果，就可以把發(fā)生了突變的βS基因檢測(cè)出來。
PCR技術(shù)問世以來，ASO診斷又有新的改進(jìn)，即先PCR擴(kuò)增長(zhǎng)約110bp的基因片段，然后再與ASO探針雜交。這樣可減少目的基因DNA用量，并降低與基因組DNA雜交時(shí)的非特異性信號(hào)。
3．基因異常不明的遺傳病的診斷
成年型多囊腎�。╝dult polycystic kidney disease,APKD)是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率高，約1000人中有1名致病基因的攜帶者，起病較晚，多在30歲以后，主要為腎和肝中出現(xiàn)多發(fā)性囊腫，臨床表現(xiàn)為腰疼、蛋白尿、血尿、高血壓、腎盂腎炎、腎結(jié)石等，最終可導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。本病基因定位在16p13，與α珠蛋白基因3’端相鄰，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明。因此，目前只能用連鎖分析來進(jìn)行基因的發(fā)病前診斷和產(chǎn)前診斷。由于通過家系分析，已證實(shí)APKD的致病基因與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)緊密連鎖，而后者在人群中具有高度多態(tài)性，因此可以通過RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷（圖13－11)。
圖13－11 成年型多囊腎病的連鎖分析診斷
從圖13－11可見，當(dāng)用3’HVR作為探針與PvuⅡ酶切后的家系有關(guān)成員基因組DNA雜交時(shí)，可見有5.7、3.4和2.4kb的3種等位片段�；颊叩哪赣H有5.7和3.4kb兩種片段，父親為2.4kb純合子，其子女凡有3.4片段者為患者，而凡無(wú)此片段者都不是患者。因此可知致病基因伴隨3.4kb等位片段分離，即與之相連鎖。圖中Ⅱ5的DNA檢查只有5.7和2.4kb而無(wú)3.4kb片段，故不是患者或致病基因攜帶者。
