�。ǘ�)酶促生物素標記cRNA探針的應用
基本方法和放射性標記cRNA探針同，所不同的是探針濃度為2.5μg/μl。顯示探針反應步驟如下。
（1)用PBS沖洗粘附有切片的載片2×3min。根據情況也可用漂洗法。
�。�2)將載片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇內30min以封閉內源性過氧化物酶。
�。�3)PBS沖洗2×3min，用吸水紙拭干切片周圍的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30)，室溫1h，或4℃過夜。
�。�4)PBS徹底沖洗。
�。�5)載片加生物素化抗小鼠IgG（1：100)30min室溫。
（6)PBS徹底沖洗。
（7)應用ABC復合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室溫。
�。�8)PBS徹底沖洗。
�。�9)將切片覆以新鮮配制的0.025%DAB溶液，0.02%H2O2,孵育3～15min。
�。�10)水洗，復染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用銀染，多層ABC或PAP法加強染色效果。
三、地高辛標記cRNA探針的應用
�。ㄒ�)基本原理
地高辛（Digoxigenin 簡寫Digo-)又稱異羥基洋地黃毒甙配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無交叉反應，地高辛配基標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP)上形成digoxigenin –11-dUTP（圖20-3)。通過隨機引物或缺口翻譯法（多用隨機引物法)，將dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構成Dig-配基標記的核酸探針。將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的羊抗高地辛抗體Tab（抗原結合片段)結合物作為酶標或熒光標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產生熒光以達到檢測目的，其反應過程見圖20-3。
圖20-3 地高辛標記的探針檢測酶聯(lián)免疫反應
常用的免疫酶學檢測方法有兩類：一是Dig –HRP（辣根過氧化物酶)檢測體系，以DAB（四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺)/H2O2為底物，結果為棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2為底物，結果為藍色。另一是Dig –AKP檢測體系：以BCIP/NBT為底物，結果為藍紫色沉淀。與免疫細胞化學方法相似，如應用酶促反應會較單一信號的標記物如熒光素具有更高的靈敏度。同樣是酶促化學反應，AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優(yōu)點為價廉、穩(wěn)定。
應用地高辛標記的核酸探針也較穩(wěn)定，據報告在-20℃貯存可達2年，隨時要取用，不像放射性標記探針有半衰期所致的時間限制。但在現實應用中，仍喜歡采用新鮮的地高辛配基標記3～6個月以內的核酸探針。為節(jié) 省核酸探針的用量，凡使用過的含有探針的雜交液也可反復多次使用，特別是對于已知的重復性實驗。對于細胞或組織內未知mRNA的檢測，仍宜采用未使用過的探針雜交液為佳。
與放射性標記相比，地高辛標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點，對人體無害，不受半衰期限制，探針可長期保存。與生物素標記探針相比，地高辛探針不受組織、細胞中內源性生物素的干擾，敏感性高。由于地高辛具有靈敏度及分辨率高，反應產物顏色鮮艷，反差好，背景染色低，制備探針可較長期保存，對人體無害等優(yōu)點，已日益顯示出它的優(yōu)越性和廣泛的應用前景。它不僅可應用于原位雜交細胞化學，還可應用于Southern印跡雜交法檢測特定基因組序列，進行RFLP分析用于基因診斷，菌落原位雜交，噬菌斑原位雜交，固定細胞及中期染色體原位雜交以及生物體液中，組織中病毒DNA序列的檢測。這一技術還被應用于檢測DNA標記物及測序，對人類染色體連鎖圖譜進行構建和基因圖譜分析。
