淋病的實驗
淋病(gonorrhea)是指由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖道的化膿性感染，如尿道炎、宮頸炎和直腸炎等。如不及時治療，淋球菌可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起附睪、前列腺、輸卵管及盆腔等器官的炎癥，甚至可經(jīng)血液傳播到全身其他部位，形成淋菌性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等合并癥。但另一方面，也有5%-20%的男性和60%的女性病人呈現(xiàn)無癥狀經(jīng)過。淋球菌好侵犯人類泌尿生殖道的柱狀上皮細胞，憑借特異的結(jié)構(gòu)和粘膜表面與醫(yī)學全在,線之相匹配的部位粘附。繼而侵入細胞內(nèi)增殖，使粘膜上皮破壞，形成炎癥，出現(xiàn)一系列癥狀。
一、淋病診斷步驟
人類尿道上皮尤其是柱狀上皮細胞對淋球菌相當敏感。在感染淋球菌后，經(jīng)過一段時間的潛伏期(平均3天~5天)。由于細菌和毒素的作用，粘膜壞死、脫落、神經(jīng)末梢暴露、炎癥浸潤、組織液滲出，病人會出現(xiàn)尿急、尿痛和尿道流膿等急性尿道炎癥狀。
淋球菌感染男性病人，常會出現(xiàn)尿痛和尿道流膿等臨床癥狀。這時取尿道分泌物作涂片，經(jīng)革蘭染色后，如見到有符合淋球菌形態(tài)特征的革蘭陰性細胞內(nèi)雙球菌，則初步診斷陽性，可對病人進行治療；如涂片查菌陰性，應從尿道取標本進行淋球菌培養(yǎng)。淋球菌感染的女病人，常僅有膿性宮頸分泌物或無癥狀。對女病人不推薦用涂片法檢查，而主張直接從宮頸取材進行培養(yǎng)。標本經(jīng)培養(yǎng)后，菌落形態(tài)典型、氧化酶試驗陽性，菌體為革蘭陰性雙球菌，則初步診斷為陽性培養(yǎng)物，如有某些性狀不符合，則可進一步用糖發(fā)酵試驗及直接免疫熒光法等作鑒定加以確診。
二、標本的采集和運送
在取材作涂片時，應先用滅菌等滲鹽水洗凈尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，用棉拭或白金耳蘸取膿液后輕輕涂布于載玻片上。待自然干燥后作染色。如由男性病人前尿道取材作培養(yǎng)時，應用白金耳或藻酸鈣拭子深入尿道2cm~4cm，取出的分泌物應略帶粘膜。從女病人的宮頸取材時，應將棉拭插入宮頸口1.5cm，稍轉(zhuǎn)動并停留10s~30s，讓棉拭充分吸附分泌物。從肛門取材時，應將棉拭插入肛門2.5cm以上，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中取材。檢查淋菌性咽炎時從扁桃體或扁桃體窩或咽后壁取材。
淋球菌對外環(huán)境因素如干燥抵抗力很弱。因此，為了保證培養(yǎng)成功，應盡量縮短標本離體時間。在醫(yī)院門診部，從病人取材后，應立即接種到培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。如取材本處離實驗室較遠時，可將標本置于無營養(yǎng)性的Stuart或Amies運送培養(yǎng)基或選擇性生長培養(yǎng)墓如Trmlsgrow中運送到實驗室。標本在無營養(yǎng)運送培養(yǎng)中(在室溫25℃條件下)，12h對分離率無影響，在24h內(nèi)分離大于90%。如需時再應使用生長運送培養(yǎng)基，但即便如此，也不應超過2天。
淋病的涂片檢查
【原理】
急性淋菌性尿道炎病人常有大量黃色膿性分泌物。在有些膿細胞內(nèi)可有許多淋球菌。淋球菌革蘭染色呈陰性反應，具有特殊的菌體形態(tài)。因此，取病人尿道分泌物制成涂片后做革蘭染色，檢查有無典型細胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌，可作初步診斷的依據(jù)。
【方法】
1．先用滅菌等滲鹽水的拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，蘸取膿液后輕輕涂布于載玻片上。待自然干燥后加熱固定，染色，鏡檢。常用革蘭染色，也可用美藍染色。
2．涂片后，待自然干燥后火焰固定，
革蘭氏染色：結(jié)晶紫染色1min。
碘媒染液染色1min。
乙醇丙酮脫色1min左右。
石炭酸復紅復染1min。
晾干后油鏡鏡檢。
【結(jié)果】
在急性病人的尿道膿性分泌物革蘭染色涂片中，�？梢姷酱罅考t色多形核白細胞。在有些細胞中吞噬有淋球菌。淋球菌為革蘭陰性，呈卵圓形或圓形，常成對排列，接觸面扁平或稍凹。菌體長約0.7m，寬約0.5m。但兩菌大小可有差異。多數(shù)多形核細胞中并不含淋菌，但不少膿細胞中常含有一至數(shù)對，甚至20對30對淋球菌，淋球菌常存在于細胞漿內(nèi)。
在病期較長的淋病病人的涂片中淋球菌比較少，有時呈單個、四聯(lián)和八疊狀，位于細胞外。對有些菌有時難以下結(jié)論，需進行培養(yǎng)和鑒定。
【注意事項】
1．涂片時不要用力涂擦，而應將棉拭在玻片上輕輕滾動，因急性病人診斷標準為見到“細胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌”。涂擦過勁，細胞破裂或變形，菌從細胞內(nèi)逸出，會造成診斷上的混淆。
2．涂片厚薄要合適。涂片過厚，加之染色過程中脫色時間不足，革蘭陰性菌也會呈現(xiàn)紫色。因此，脫色時間要視涂片厚薄而定。在大量染片時，最好用一已知的革蘭陽性菌(如葡萄球菌)和陰性菌(如大腸桿菌)作對照。
3．固定涂片，只要將涂片迅速通過火焰2~3次，避免加熱過度使細胞變形扭曲。當把加熱的涂片放到手背上時應不感到太燙。
4．不推薦用涂片檢查來診斷淋菌性直腸和咽部的感染，也不推薦用作判愈。
【臨床意義】
涂片檢查方法簡便、有效、價格低廉且有一定的敏感性和特異性。但其特異性隨著取材部位的不同而有所不同。例如，從男性尿道取材特異性高，而從女性宮頸取材特異性低。因女性宮頸分泌物中雜菌很多，有的在形態(tài)上很像淋球菌。因此，世界衛(wèi)生組織不推薦用涂片法來檢查女性病人。
淋球菌的分離培養(yǎng)
【原理】
如果標本中有淋球菌，則在合適的培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后可長成菌落。各種細菌在培養(yǎng)基上生長成的菌落形態(tài)各不相同。根據(jù)菌落的大小、表面高起或扁平、光澤、色素和邊緣的情況等，作為細菌鑒定的標準。
【方法】
1．取材
培養(yǎng)要獲得成功，取材的部位和方法要準確。由男性病人前尿道取材時，應該用細小棉拭子或藻酸鈣拭子或白金耳伸入尿道口2cm~4cm，取出的分泌物應略帶粘膜。從女病人的宮頸取材時，應先用溫水濕潤擴陰器(不要用液體石蠟等潤滑油)。應將棉拭插入宮頸口1.5cm處，稍轉(zhuǎn)動并停留10s~30s，讓棉拭充分吸附分泌物。從直腸取材時，應將棉拭插入肛門2.5cm以上，如果棉拭碰到糞便，應換一個棉拭重取。檢查淋菌性咽炎時，應從扁桃體及扁桃體窩取材。為了提高陽性率，可同時取二份標本進行培養(yǎng)。
2．培養(yǎng)基
由于淋球菌的營養(yǎng)要求較復雜，所用的培養(yǎng)基中應含有動物蛋白及細菌生長所需的各種因子。目前國內(nèi)常用的是血液瓊脂或巧克力瓊脂。為抑制雜菌，在培養(yǎng)基中可加入少量抗菌物質(zhì)如多粘菌素B(25g/ml)和萬古霉素(3.3g/ml)等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，濃度為8%~10%。但避免血液中加入抗凝劑等藥物。培養(yǎng)基的pH值以7.4為好。目前國外常用的培養(yǎng)基有Thayer-Martin(T-M)培養(yǎng)基、NewYork City(NYC)培養(yǎng)基和Martin-Lewis(ML)培養(yǎng)基等。T-M培養(yǎng)基是在GC基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入血紅蛋白(1%)、抗生素(萬古霉素3g/ml、粘菌素7.5g/ml和制霉菌素12.5g/ml)和淋球菌增菌劑，使絕大多數(shù)雜菌被抑制而淋球菌菌落長得較大，在乎皿中幾乎呈純培養(yǎng)，從而大大提高了由子宮頸、尿道，尤其是咽和直腸部位分離出淋菌的陽性率。
3．培養(yǎng)條件
淋球菌對外環(huán)境變化頗為敏感，對寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，為了保證培養(yǎng)有足夠的成功率，取材后應立即接種，標本離體時間越短越好。取材處離實驗室距離較遠時，應將標本接種于Smart或Amies運送培養(yǎng)基或1%葡萄糖肉浸液中，并注意在運送過程中保溫。接種的血平皿應先放在37℃溫箱中預溫。培養(yǎng)的最適溫度為35℃~36℃，超過38.5℃或低于30℃便生長不良。因此，孵育的溫度要恒定。淋球菌為需氧菌，但最初從人體分離時，為促進生長，需用5%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)。為保持一定的濕度，可在培養(yǎng)缸中放些浸水棉球。
【結(jié)果】
淋球菌在血平皿上經(jīng)24h~48h的培養(yǎng)后，可形成圓形、凸起、濕潤、光滑、半透明或灰白色菌落。邊緣呈花瓣狀，直徑為0.5mm ~1.0mm。用白金耳觸之有粘性。如繼續(xù)培養(yǎng)，菌落面積增大，表面變得粗糙，邊緣出現(xiàn)皺縮。若從菌落上取材作涂片，可見到菌的大小及染色的深度有差異，排列也不一致，約有25%的菌為典型的雙球菌，其他75%為單球菌、四聯(lián)形或八疊形。
淋球菌在液體培養(yǎng)基中生長于液體表面，或稍有輕度混濁和顆粒沉淀。
【注意事項】
1．培養(yǎng)要獲得成功，取材是關(guān)鍵之一。取材的深度一定要夠，因為淋球菌好發(fā)于柱狀上皮細胞而不是復層鱗狀上皮細胞。男性尿道前端包括舟狀窩都為復層鱗狀上皮覆蓋，所以要深人到尿道內(nèi)2cm~4cm處，并蘸取少量粘膜，陽性率才高。女性病人取材時，要求將棉拭插入宮頸管，轉(zhuǎn)動并停留10s~30s也是這個道理。有些人只在陰道口取少量分泌物作分離培養(yǎng)，陽性率當然會降低，因為有生活力的菌從宮頸隨分泌物由陰道流出需一定時間，陰道內(nèi)pH值低，又因各種雜菌的作用，到陰道口時淋菌的生活力較低，再加上培養(yǎng)過程中各種因素的影響，培養(yǎng)成功的機會就會減少。
2．對癥狀不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后2~3h之后。另外，采樣者應熟練掌握前列腺按摩術(shù)，必要時作前列腺按摩取材。
3．對女性淋病的檢查主張用淋球菌培養(yǎng)。國內(nèi)目前使用血液瓊脂加入多粘菌素作抑菌劑效果尚可。但蛋白胨最好用進口的(Oxoid公司產(chǎn)品或日本產(chǎn)或Polypepton等)，并用肉浸液加酵母浸膏等為好。
4．國內(nèi)目前使用的血液瓊脂或巧克力瓊脂中加人多粘菌素和萬古霉素以分別抑制革蘭陰性和革蘭陽性雜菌。但由于部分淋球菌(某些地區(qū)可高達5%)對萬古霉素也敏感，因此，最好不用萬古霉素。
5．淋球菌在血平板上培養(yǎng)24h，雖能見到菌落，但個兒很小，難以辨認其特點。24h~36h，菌落迅速長大。所以觀看菌落特征最好在36h左右。超過36h，菌落特征也會有較大的改變。
【臨床意義】
淋球菌培養(yǎng)用作診斷和某些特殊目的。培養(yǎng)法對男性及女性標本都是適用的，是世界衛(wèi)生組織推薦的篩查淋病病人的唯一方法，也是診斷淋病的金標準方法。
初步鑒定試驗
革蘭染色
【原理】
淋球菌有特定形態(tài)。挑取可疑菌落在玻片上制成鹽水涂片，經(jīng)革蘭染色，若見到具淋菌特征形態(tài)的雙球菌，可作出初步診斷。
【方法】
在載玻片上加鹽水一滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革蘭染色。
【結(jié)果】
可見革蘭陰性球菌。菌體為0.7m×0.5m大小，呈腎形或卵圓形。約1/4為雙球菌，多數(shù)為單球菌，個別呈四聯(lián)或八疊狀。與分泌物涂片所見不同，此涂片中無白細胞。
【注意事項】
1． 涂片厚薄要均勻，革蘭氏染色正確，必要時做陰性和陽性對照。
2． 陳舊的培養(yǎng)物，涂片顏色結(jié)果不典型，應取新鮮培養(yǎng)物。
【臨床意義】
典型革蘭氏陰性雙球菌表明可能為淋球菌，但必須進一步做試驗鑒定。
氧化酶試驗
【原理】
淋球菌在生長過程中產(chǎn)生氧化酶。往培養(yǎng)基上生長了24h~48h的菌落上加氧化酶試劑(0.5%~1%新配制的鹽酸四甲基對苯二胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液)，淋球菌菌落的顏色可變成紫紅乃至黑色。
【方法】
1．在混有雜菌的淋球菌分離平皿上滴加氧化酶試劑后變成紫紅色的菌落為氧化酶試驗陽性。
2．也可先挑取可疑菌落涂于干濾紙條上，滴加試劑，涂菌處變成紅色者為陽性。
3．或先滴一滴試劑于濾紙條上(勿太濕)，再涂菌落，觀察顏色變化。
【結(jié)果】
淋球菌氧化酶陽性，但氧化酶陽性者并不一定是淋球菌。
【注意事項】
1．為了保證育良好的反應，所用氧化酶試劑不應過分陳舊。正常的氧化酶試劑
(鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸四甲基對苯二胺)應為談紅色。如果試劑買來時已成灰色或黑色，說明已失效而不應使用。試劑溶液配好后應放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用一周。
2．氧化酶試劑遇鐵也會出現(xiàn)紅色而造成假陽性，所以操作用的接種環(huán)應避免用舊鐵絲或電爐絲等制成．并在每次試驗前先檢查是否末挑茵的接種環(huán)接觸試劑就有紅色出現(xiàn)。
3．鹽酸四甲基對苯二胺比鹽酸二甲基對苯二胺敏感，將一滴鹽酸叫甲基對苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快變?yōu)樯钭仙⒈Ａ舭敕昼娨陨蟿t為陽性。所以，在測定杜克雷菌等氧化酶試驗弱陽性的菌株時，最好用前者。
4．如需保留菌種，在菌落末完全變黑時可挑少許轉(zhuǎn)種。菌落一旦變黑，多數(shù)菌即告死亡。
【臨床意義】
氧化酶試驗試劑易得、操作簡便，是淋球菌重要的初步診斷試驗之一。標本涂片菌體形態(tài)符合淋菌特征，培養(yǎng)長出淋菌菌落，加上氧化酶試驗陽性，即可做出初步診斷，開始治療。如某些性狀不符，則應進一步作確診試驗。
確證鑒定試驗
糖發(fā)酵試驗
【原理】
淋球菌有分解葡萄糖的酶類，當它分解葡萄糖時產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基的pH值降
低，因而培養(yǎng)基中的指示劑顏色改變，如酚紅由紅變黃，溴甲酚紫由紫變黃。
【方法】
世界衛(wèi)生組織推薦的快速非生長的糖發(fā)酵微量法操作如下：
1．用無選擇性的巧克力或哥倫比亞瓊脂平皿(含5%馬血或羊血)轉(zhuǎn)種受檢菌株，以獲得純菌。挑取培養(yǎng)18h~24h的純菌2滿環(huán)(直徑3mm)混懸于0.3ml~0.4ml緩沖平衡鹽指示溶液(BSS)中，制成濃濁菌懸液。每升BSS中含磷酸氫二鉀0.4g，磷酸二氫鉀0.1g，氯化鉀8g，酚紅0.6g，pH值為7.1~7.2。過濾滅菌后儲存于4℃冰箱備用。
2．用5支70mm×10mm小試管，在1管~4管中分別加入20%經(jīng)過濾滅菌的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖溶液各0.05ml。第5管不加糖(對照管)。
3．每管加0.1mlBSS。
4．每管加0.05ml菌懸液，充分混勻。在37℃水浴箱中孵育4h，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
淋球菌發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵其他糖。因此，只有葡萄糖管的pH值下降，顏色由紅變黃。其他糖管顏色不變。
幾種奈瑟菌的糖發(fā)酵反應情況
葡萄糖 麥芽糖 蔗 糖 乳 糖
淋球菌 + - - -
腦膜炎球菌 + + - -
干燥球菌 + + + -
Ⅰ型黃色球菌 + + + -
Ⅱ型黃色球菌 + + - -
Ⅲ型黃色球菌 + + - -
粘液球菌 + + + +
卡他球菌 - - - -
【注意事項】
1． 用于糖發(fā)酵試驗的糖純度要高（尤其是麥芽糖中含葡萄糖必須<0.25%)。最好用進口的分析純試劑。麥芽糖中混入了葡萄糖，可能產(chǎn)生使人誤解的結(jié)果。
2． 用作試劑的菌要純。如混有雜菌，會使結(jié)果雜亂無章。
3． 應該使用18h~24h的淋球菌培養(yǎng)物。如使用超過24h的培養(yǎng)物，可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
4． 現(xiàn)已有一些滿意的商品化糖發(fā)醇試驗，如Minitek（BBL公司)。做時浸有高濃度糖的紙片放到一塑料凹槽中，加入濃厚菌懸液，孵箱中培養(yǎng)，多數(shù)反應發(fā)生在4h之內(nèi)。個別菌株可培養(yǎng)過夜后讀結(jié)果。
5． 緩沖液不合適或培養(yǎng)在二氧化碳孵箱中，會使所有糖管均變黃。
6． 使用胱氨酸胰酶瓊脂（CTA)作糖發(fā)酵試驗時，可用接種針將菌種入培養(yǎng)管的上1/3。如將瓊脂量由1%增加到1.5%，糖含量由1%增加到2%，則糖發(fā)酵的時間可縮短到4h。如將糖發(fā)酵管放到37℃水浴中，則看結(jié)果的時間可縮短。
【臨床意義】
糖發(fā)醇試驗是淋球菌的鑒定試驗之一。確證和區(qū)別其它奈瑟氏菌。
SPA協(xié)同凝集試驗
【原理】
金黃色葡萄球菌的A蛋白具有吸附抗體IgG Fc段的特性。因此，挑選金黃色葡萄球菌的某些菌株(有市售)，與淋球菌特異性膜蛋白的小鼠單克隆抗體作用(致敏)，然后用其來檢查待檢株，如是淋球菌，則淋球菌菌體抗原和吸附于金黃色葡球菌上的抗淋菌單克隆抗體起作用，單抗又結(jié)合著金黃色葡萄球菌，從而產(chǎn)生凝集反應，如待檢菌不是淋球菌，則不產(chǎn)生凝集反應，試驗為陰性。
【材料】
以GonococcalOMNIReagent試劑盒為例，材料包括：
1． 協(xié)同凝集試劑1瓶。為抗淋球菌抗原的小鼠單克隆抗體(1A和1B)，已結(jié)合在滅活的金黃色葡萄球菌上。
2． 陰性對照試劑1瓶。為未免疫家兔的血清，也已結(jié)合于滅活的金黃色葡萄球菌上,作陰性對照用。試劑的有效期寫在標簽上。
【方法】
1．將已經(jīng)初步診斷為淋球菌的菌落，接種于培養(yǎng)基中，于35℃~7℃(含5%~7% 二氧化碳的潮濕環(huán)境中)培養(yǎng)16h~24h。
2．將生長的菌落在0.5ml等滲鹽水中制成1×108菌體/ml的菌懸液。在沸水中水浴5min。為防蒸發(fā)水浴時應加蓋。
3．在試驗紙片上加試劑和陰性對照液各1滴。
4．在二種試劑上各加1滴經(jīng)水浴的菌懸液。菌懸液在加之前需充分混勻。
5．用一次性環(huán)充分混和菌懸液和試劑。每種試劑各用一新環(huán)。
6．傾斜搖動紙片，在1min內(nèi)判定結(jié)果。
【結(jié)果】
所檢菌與試劑起凝集反應者為陽性，和本試劑無反應者為陰性。
判定結(jié)果之標準為：
(4+)：凝集成大塊，液體透明；
(3+)：凝集成大小不等之團塊，液體透明；
(2+)：凝集成小團塊或小顆粒，液體透明；
(+)： 凝集成散在細小的顆粒，速度慢，液體不透明；
(－)： 無明顯凝集，液體混濁。
以2+以上為試驗陽性。
【注意事項】
1．本試驗的敏感性有限。因此，一般用作可疑菌的鑒定，作進一步確診用。如直接用來檢查標本(診斷)，�？梢驑吮局芯可佟㈦s菌多(尤其是女性標本)而呈陰性。即使本試驗陽性，臨床醫(yī)生也不應僅根據(jù)單一的試驗來作出診斷，而應綜合臨床和實驗室資料后謹慎作出。
2．本試驗的特異性實際上取決于吸附于金黃色葡萄球菌上的淋球菌單克隆抗體的特異性。特異性強的單抗，可用來區(qū)別淋球菌和腦膜炎球菌、干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌、淺黃奈瑟菌、粘液奈瑟菌和粘膜炎布蘭漢球菌。這些菌都可在無癥狀者的鼻咽腔粘膜上發(fā)現(xiàn)，偶爾可在生殖道粘膜上發(fā)現(xiàn)。
3．制備菌懸液時，鹽水的酸堿度頗為重要，通常要求pH值在7.0~7.5之間。pH值過低會出現(xiàn)非特異性凝集反應。
4．為使結(jié)果易于觀察，可將試劑(金黃色葡萄球菌)染成藍色。
5．實驗是穩(wěn)定的，但觀察結(jié)果應在1min內(nèi)判定。試驗物干時結(jié)果會受干擾。
6．為對試驗進行質(zhì)量控制，每次試驗應設(shè)陽性對照和陰性對照。陽性對照液是一瓶特異的淋球菌純培養(yǎng)提純物。如果待檢菌不是淋球菌而是其他奈瑟菌，則試劑和它無反應。陰性結(jié)果強烈提示試驗不是淋球菌。
【臨床意義】
本試驗主要用作淋球菌的鑒定以進一步確診。另外由于目前已制成抗淋球菌蛋白工、Ⅱ和Ⅲ型的單抗，用它制成不同血清型的協(xié)同凝集試劑，因此，本試驗也可用于淋球菌的初步血清學分型。
淋球菌對藥物的敏感性測定方法
檢測淋球菌對抗生素的敏感性，可用來檢測是否產(chǎn)生了耐藥株及其比率，為修訂淋病治療方案和制訂對策提供重要流行病學資料。
K-B法抗生素藥敏試驗
【原理】
將含藥紙片貼到涂有淋球菌的培養(yǎng)基上，藥物即擴散到瓊脂中。如果淋球菌對此藥敏感則生長被抑制，在紙片周圍形成一個透明的抑菌圈。瓊脂中藥物濃度與紙片距離成反比，距紙片越遠藥物濃度越小。因而，可根據(jù)抑菌圈的大小判定細菌對該藥的敏感程度。
【方法】
1． 用無選擇性培養(yǎng)基(如巧克力培養(yǎng)基)再次分離淋球菌。挑取符合標準的淋菌菌落轉(zhuǎn)種，置36℃燭缸培養(yǎng)18h～24h，以得到純菌。
2． 刮取菌苔洗于M-H肉湯中，振蕩，獲得均勻的菌液。用McFarland比濁管比濁成1×109/ml濃度。
3． 用滅菌棉拭蘸取菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，待干。為使菌液干得較快，可先將培養(yǎng)基平皿在試驗前于37℃孵箱中半開蓋烤20min~30min，除去表面水分。
4． 用無菌鑷子將各種藥物紙片緊貼于培養(yǎng)基表面。要求每張紙片中心問的距離不少于24mm。每個90mm的平皿可均勻貼7張紙片。然后放燭缸于350C孵箱或潮濕的含5%～10%CO2孵箱培養(yǎng)。
5． 培養(yǎng)16h～18h(也可24h)觀看結(jié)果。
檢查平皿并測量抑菌完全的抑菌圈直徑。參照標準報告結(jié)果。
【結(jié)果】
淋球菌抑菌圈直徑判斷標準
藥 物 紙片中藥物含量 抑 菌 圈 直 徑（mm)
耐 藥 中間值 中間敏感 敏 感
青 霉 素 10IU ＜＝26 - 27-46 ＜＝47
頭孢曲松 30g - - - ＜＝35
壯觀霉素 100g ＜＝14 15-17 - ＜＝18
四 環(huán) 素 30g ＜＝19
環(huán)丙氟哌酸 5g - ＜＝36
氟 哌 酸 5g - - - ＜＝31
【注意事項】
1． 目前用于治療淋病的藥物可分為7大類，每類藥中只要選一種為代表試驗，其敏感程度即可代表其他同類藥的敏感性。（1)青霉素類，包括青霉素C、氨芐青霉素、羥氨芐青霉素，其代表抗生素是青霉素G；（2)四環(huán)素類，包括鹽酸四環(huán)素、強力霉素和二甲胺四環(huán)素，代表性抗生素是鹽酸四環(huán)素；（3)壯觀霉素類；（4)第二、三代頭孢菌素，包括頭孢甲氧噻吩、頭孢呋肟和頭孢曲松，可任選一種作敏感性試驗；（5)氯霉素類，包括氯霉素和甲砜霉素可任選一種作代表；（6)氨基甙類抗生素主要是卡那霉素；（7)喹諾酮類藥包括氟哌酸、氟嗪酸、和環(huán)丙氟哌酸，代表性藥物是氟哌酸。
2． 雖然M-H瓊脂用于敏感性試驗一般來說是可靠的，但偶爾在某些批號間有顯著差異。如果一種批號的培養(yǎng)基不能適合待試菌的生長，擴散試驗中所得抑菌圈直徑通常變大，可能超出質(zhì)控范圍，而且可以產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。
3． 應使用培養(yǎng)18h～24h的菌落制成懸液并立即將懸液調(diào)至1×108/ml的濃度。為比濁準確起見，應將試管對著白底黑線卡。有些試驗裝置可使接種物直接標準化而不需調(diào)整。
4． 在將菌株懸液濃度調(diào)整后的15min內(nèi)，用棉拭蘸菌液在經(jīng)過烘干的GC培養(yǎng)基整個表面密集涂布。每次將平皿旋轉(zhuǎn)60°，以確保接種物均勻分布。如培養(yǎng)皿涂布滿意且接種物正確，則抑菌圈為一致的圈形，菌在平皿中為融合生長。如為孤立的菌落生長，說明接種物過少。接種后蓋上平皿蓋放置3min～5min，使多余的水分被吸干，然后再貼藥敏紙片。避免接種物過濃，不能用未經(jīng)稀釋的培養(yǎng)過夜和肉湯培養(yǎng)物接種平皿。所用肉湯的pH值應在7.2～7.4。
5． 將適宜的藥物紙片放于接種菌液的瓊脂平皿上，用鑷子或針尖將每個紙片輕輕壓在瓊脂表面以確保完全貼緊。由于某些藥物的擴散極快，紙片一旦貼到平皿上就不要再移動。
6． 培養(yǎng)16h～18h后，檢查平皿并測量抑菌完全的抑菌圈直徑（也包括紙片的直徑)。測量最小達毫米水平，用游標卡、普通尺或特殊的模板來讀取結(jié)果。在抑菌圈邊緣，肉眼勉強可見不明顯的細小菌落生長的地方即為判定終點。在明顯的抑菌圈內(nèi)有大菌落生長時應對它傳代培養(yǎng)，重新鑒定，并重新試驗。抑菌圈通常掄廓清楚，朦朧的微弱生長可忽略不計。
7．用于敏感性試驗的含藥紙片，一般需分開裝瓶，包裝中須確保防潮。為了長期保需：
（1) 據(jù)藥物的性質(zhì)需冷藏（8℃或以下)或－14℃以下冰凍保存。
（2) 為了保持紙片的藥效，β-內(nèi)酰胺族的含藥紙片需要凍存，少量因工作需要的可在冷藏條件下保存到—周。
（3) 試驗前將冷藏箱或冰柜中未開封的紙片容器取出，放置1~2h使它們與室溫平衡，然后再打開容器，這樣可減少熱空氣與冷的紙片容器發(fā)生冷凝現(xiàn)象。
（4) 當使用—種特殊的紙片分配器時，必須將其蓋緊，并附有指示性干燥劑。在打開前須使其與室溫平衡。當干燥指示劑變色時應及時更換以免過潮。
（5) 在不使用的情況下，應將裝有紙片的分配配冷藏。
（6) 紙片應在有效期內(nèi)使用，已到失效期的紙片應扔掉。
【臨床意義】
紙片擴散法是檢測淋球菌對抗生素敏感性的最常用的方法。但紙片法受多種因素影響，結(jié)果常不夠穩(wěn)定，不少學者認為，本試驗的目的主要是用以指導治療�！懊舾小碧崾居盟囁幬镆詷藴蕜┝窟M行治療時失敗的可能性＜5%；“耐藥”提示臨床治療的失敗率＞15%；“中等”結(jié)果提示病人用標準劑量的被試抗生素治療，預期失敗率為5%～15%，固而在大部分中度敏感的病人，用較高劑量或延長療程則治愈率仍可＞95%。若對本地區(qū)菌株進行系統(tǒng)耐藥監(jiān)測，則應用瓊脂稀釋法測定每年菌株的MIC。
瓊脂稀釋法（MIC)
【原理】
將待檢菌株種于含有不同抗菌藥物的瓊脂平皿上，藥物濃度h細菌生長，藥物濃度高時細菌生長被抑制，據(jù)此可測出藥物對該菌的最小抑菌濃度，依標準判定菌是否為耐藥菌株。
【方法】
1． 精確稱取純品抗生素，溶于合適的溶劑中，用蒸餾水稀釋后加到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中藥物的濃度由少到多逐倍遞增。
2． 對待檢菌作初步鑒定之后挑取符合標準的菌落作純培養(yǎng)，于36℃二氧化碳燭缸中培養(yǎng)24h。
3． 用接種環(huán)刮下菌苔，用M-H肉湯制成1×107/ml的懸液。
4． 用多頭接種器或特制接種環(huán)挑取菌液（約1l～2l)接種到含不同濃度藥物的瓊脂平皿上。同常規(guī)法培養(yǎng)，次日判定結(jié)果。
【結(jié)果】
淋球菌對藥物的敏感度是指淋球菌不生長的藥物最高稀釋度。常用g/ml或mg/L表示。此數(shù)值也即該藥對此菌的最小抑菌濃度（MIC)。世界衛(wèi)生組織要求監(jiān)測的藥物的敏感度（青霉素、四環(huán)素、壯觀霉素、頭孢三嗪、環(huán)丙氟哌酸)。
【注意事項】
1．抗生素應為純品，應川精密天平稱量。
2．在制備抗生素貯存液時所用的溶劑隨抗生素種類而異。
3．根據(jù)當?shù)啬退幩降臐舛确秶x擇制備平板中抗生素的含量。
4．含易分解的抗生素(如青霉素)的培養(yǎng)基建議在3天內(nèi)用完，其他的可用一周。
5．應用世界衛(wèi)生組織A、B、C、D、E五株參考菌株作質(zhì)控。
【臨床意義】
瓊脂稀釋法是目前測定淋球菌對藥物的敏感度的最為準確的方法，重復性好,結(jié)果較為可靠。所獲資料可作為對當?shù)亓餍芯昴退帨y定的依據(jù)。但MIC在耐藥范圍的菌株，其產(chǎn)生機理可不同。如對青霉素在耐藥范圍的淋球菌菌株不一定全是PPNG菌株。PPNG菌株是由質(zhì)粒介導的產(chǎn)青霉素酶的淋球菌。此外，還有由染色體突變而產(chǎn)生的耐青霉素菌株，它不產(chǎn)生青霉素酶。
產(chǎn)青霉素酶淋球菌菌株(PPNG)測定
青霉素瓊脂法
【原理】
某些淋球菌菌株獲得耐藥質(zhì)粒后產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。該酶能分解青霉素，使培養(yǎng)基的pH值降低，培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變。
【材料】
配制培養(yǎng)基(用3 000ml燒瓶配制)：瓊脂30g加蒸餾水2000ml，用1mol/L NaOH溶液調(diào) pH值至10.8，加入0.5%酚紅溶液20ml，充分混合后煮沸。檢查瓊脂是否充分溶解，冷卻到50℃，pH值8.5，以無菌手續(xù)加人青霉素(600mg)10支(每支先用4ml蒸餾水溶解)充分混勻后倒平皿，每65mm的平皿倒入13ml。
【方法】
1．將待測菌株培養(yǎng)過夜。
2．用接種環(huán)刮取菌苔涂于青霉素瓊脂上，約綠豆大小。
3．蓋蓋后于37℃孵箱培養(yǎng)30min，觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
產(chǎn)酶菌株分解青霉素產(chǎn)生青霉噻唑酸使培養(yǎng)基pH值降低，顏色由紅變黃。
【臨床意義】
用于檢測淋球菌是否為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株。
碘量法（β-內(nèi)酰胺酶測定)
【原理】
β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸，它與淀粉競爭游離碘, 破壞了碘和淀粉的藍色復合物，使藍色變?yōu)闊o色。
【方法】
1．將0.25g青霉素溶于41.7ml pH值6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000μg/ml。取0.1ml于一小試管中。
2．將培養(yǎng)18h～24h的菌在含青霉素試管內(nèi)制成濃厚菌懸液(109/ml)。
3．在37℃水浴中放置30min，不時搖動，使酶能破壞青霉素。
4．加入1%可溶性淀粉溶液0.05ml，搖動。
5．加入碘液0.02ml。
6．在37℃水浴中放置10min。觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
在10min內(nèi)能使藍色完全消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽性，不消褪者為陰性。
【注意事項】
1．由于青霉素溶液很易分解，因而用于試驗的青霉素溶液應新鮮配制。如試驗的工作量大，青霉素溶液配成后可分裝于試管中，在低溫冰箱(－25℃)凍存起來。但即使這樣，保存時間也不宜太長。
2．淀粉液最好新鮮配制。在100ml,蒸餾水中加入1g可溶性淀粉，放到開水中水浴直到淀粉溶解。貯于冰箱不要超過1周。
3．碘液如產(chǎn)生沉淀應新配制。
4．試驗應按步驟操作，如果碘加得過早，酶反應就會停止，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
7． 每次試驗最好用已知的陽性菌株和陰性菌株作對照。
