藥理學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):綜合性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/B>

1．學(xué)習(xí)離體在位蟾蜍心臟的恒壓灌流法，觀察前、后負(fù)荷和心肌收縮性能對(duì)心功能的影響，并描繪心功能曲線的變化；

2．制備實(shí)驗(yàn)性全心衰的動(dòng)物模型；

3．觀察強(qiáng)心藥物對(duì)衰竭心肌的治療作用。

實(shí)驗(yàn)原理

一般作為衡量心功能的指標(biāo)是心輸出量（心輸出量ml/min=每搏輸出量ml/次×心率 次/min)。在此次實(shí)驗(yàn)中利用離體在位的蟾蜍心臟，消除了神經(jīng)反射對(duì)心率變動(dòng)的影響，所以相當(dāng)于在心率基本恒定的情況下，主要考慮每搏輸出量對(duì)心輸出量的影響。前者反映了心肌舒縮力量與作功的大小，它受前、后負(fù)荷和心肌收縮性等基本因素的影響。在一定范圍內(nèi)，回心血量增加，心室舒張末期容積（前負(fù)荷)增加，使心肌纖維初長(zhǎng)度拉長(zhǎng)，心肌收縮力加強(qiáng)，每搏輸出量增加，即F-Starling定律。當(dāng)心室后負(fù)荷（如大動(dòng)脈壓)增加時(shí)，即心室收縮射血克服阻抗增加，心室壁收縮期張力增大，作功增加。醫(yī).學(xué)全在線心肌收縮性能改變是指心肌內(nèi)在收縮機(jī)制改變所引起的收縮力量的改變，與前、后負(fù)荷無(wú)關(guān)，而可受去甲腎上腺素、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)和體液因素的影響。改變心肌收縮性能可使心功曲線左移或右移。

本實(shí)驗(yàn)以過(guò)度增加心臟的前、后負(fù)荷與利用硫酸鎘競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ca²⁺內(nèi)流，降低心肌收縮性制備出全心衰模型。

洋地黃因使心肌細(xì)胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶活性減低，異丙腎上腺素則作為膜β受體激動(dòng)劑，對(duì)衰竭心肌都有一定治療作用，而普奈洛爾作為β受體阻斷劑，可拮抗β受體激動(dòng)劑的強(qiáng)心作用。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 

蟾蜍或蛙

器械、藥物

蛙類手術(shù)器械一套，恒壓灌流裝置一套，10ml量筒，小燒懷，動(dòng)、靜脈插管，計(jì)算，器滴管，坐標(biāo)紙，任氏液，1：10，000去甲腎上腺素，1：10，000乙酰膽堿，2×10^－6～2×10^－5硫酸鎘任氏液，0.2％地高辛，0.2%普奈洛爾（按片劑重量計(jì)算)，0.001%異丙腎上腺素。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、離體在位心臟灌流標(biāo)本的制備

1、破壞蛙腦和脊髓，將其仰臥放在蛙板上，用外科剪于劍突處向兩側(cè)鎖骨肩峰端呈三角形剪開皮膚，用粗剪剪開胸壁，切勿損傷心臟，剪去胸骨、鎖骨，用蛙釘把兩前肢固定在蛙板上。用鑷子提起心包膜，用眼科剪仔細(xì)將其剪開，暴露心臟。

2、分離出左、右主動(dòng)脈，在其下方穿兩根線備用。用玻璃分針將心臟翻向頭側(cè)，可看到靜脈竇與下腔靜脈（后腔靜脈)。小心分離并剪開與下腔靜脈相連的心包膜組織在其下穿一根線備用。

將剛才穿于主動(dòng)脈下的其中一根備用線從下腔靜脈下繞過(guò)，結(jié)扎此線，便把兩主動(dòng)脈和下腔靜脈以外的全部血管扎住，結(jié)扎過(guò)程中切勿扎到靜脈竇。再把穿于主動(dòng)脈下方的另一根線結(jié)扎右主動(dòng)脈。

3、用鑷子夾住下腔靜脈的上壁少許，用剪刀沿鑷子下緣剪一小口，將事先充滿任氏液（不含氣泡)的靜脈插管插入此切口，直至靜脈竇內(nèi)，用備用線結(jié)扎固定。翻轉(zhuǎn)心臟向下，提起左主動(dòng)脈，在左主動(dòng)脈盡量長(zhǎng)的遠(yuǎn)端剪一斜形切口，然后用充滿任氏液的吸管插入心室，沖洗并反復(fù)數(shù)次（目的是避免血液堵塞插管)。注意不要進(jìn)氣泡。

4、將事先充滿任氏液的動(dòng)脈插管向心性插入，作為心搏出口，并用線結(jié)扎固定。

5、把靜脈插管與橡皮管1相連，但先不打開夾子；把動(dòng)脈插管與橡皮管2相連

二、觀察項(xiàng)目

1、每分輸出量和有效心功率的計(jì)算方法

（1)每分輸出量：用小燒杯收集心臟搏出的灌流液1分鐘，用小量筒測(cè)定搏出液量（ml)。同時(shí)計(jì)數(shù)心率（次/分)。

（2)計(jì)算：

有效心功率=心輸出量′心功管高度（側(cè)管高度)′水密度

（g×cm/min)（ml/min)  （cm) （1g/ml)

（3)肉眼觀察心舒張容積、心肌收縮力量變化。

2、觀察實(shí)驗(yàn)因素對(duì)每分輸出量和有效心功率的影響

（1)改變前負(fù)荷（后負(fù)荷固定)：把皮管2固定在約高于心臟3cm的水平，調(diào)節(jié)貯液瓶高度，使“零點(diǎn)”分別處于5cm、10cm、15cm……等高度，觀察心舒容積和心肌收縮力量的變化，同時(shí)分別依次測(cè)定各高度下的心輸出量、心率、每搏輸出量并即時(shí)算出有效心功率。若有效心功率曲線平移時(shí)，便恢復(fù)“零點(diǎn)”在5cm的水平。找出最適前負(fù)荷（即心臟不過(guò)分充盈擴(kuò)張而心輸出量又較高的“零點(diǎn)”高度)。注意：“零點(diǎn)”在5cm時(shí)，搏出量應(yīng)保持在20~30滴/分（在橡皮管1處用螺旋止水夾控制)。以下個(gè)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中所取的固定前負(fù)荷=最適前負(fù)荷-5cm。

（2)改變后負(fù)荷（前負(fù)荷固定)：把前負(fù)荷固定在“固定前負(fù)荷”，改變橡皮管2的高度（每次間距為5cm)觀察并記錄上述（1)中各項(xiàng)指標(biāo)。

注意：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每改變一次側(cè)管高度，要穩(wěn)定1~2分鐘，再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)側(cè)管高度超過(guò)心臟代償范圍至有效心功率曲線平移或下降（即心衰)時(shí)，就不能再提高側(cè)管高度。恢復(fù)皮管2約高于心臟3 cm水平，待心輸出量基本達(dá)到本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前的水平并以此作為對(duì)照，進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。（下面的各次實(shí)驗(yàn)也遵循此原則)。

（3)心肌收縮性能改變：將前后負(fù)荷固定，用滴管將1:10 000去甲腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察心率、心輸出量和有效心功率的變化。用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，按上法滴加1:10 000乙酰膽堿1~2滴滴于心臟表面，觀察和記錄上述指標(biāo)的變化。

（4)異丙腎上腺素：用任氏液沖洗心臟表面，把乙酰膽堿沖洗干凈，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，用滴管將0.001%異丙腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。

（5)普奈洛爾：用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，按上法滴加0.2%普奈洛爾2~3滴滴于心臟表面，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化,待出現(xiàn)作用時(shí)，立即重復(fù)（4)步驟操作。

（6)硫酸鎘：用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，用2′10^-6M硫酸鎘任氏液代替任氏液灌流心臟，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。

（7)強(qiáng)心甙藥物：在用硫酸鎘灌流的心臟出現(xiàn)心衰表現(xiàn)后（心輸出量和有效心功率明顯下降)，用滴管滴加0.2%毒毛旋花子素K（或0.2% 地戈辛)1~2滴于心臟表面，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)或接近給予強(qiáng)心甙藥物前狀態(tài)后，用滴管將0.001%異丙腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。

注意事項(xiàng)

1．實(shí)驗(yàn)過(guò)程中勿用手捏拿心臟，以免損傷心臟。

2．心臟表面應(yīng)經(jīng)常滴加任氏液，以保持濕潤(rùn)。

3．整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，管道不要扭曲。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

1.通過(guò)一些神經(jīng)體液因素來(lái)改變腎血流量、體液晶體滲透壓及腎小管對(duì)電解質(zhì)的重吸收，并觀察它們對(duì)尿生成的影響。

2.復(fù)制急性中毒性腎衰動(dòng)物模型：觀察中毒家兔的一般狀態(tài)。通過(guò)幾項(xiàng)反映腎臟功能指標(biāo)和尿常規(guī)的檢測(cè)以及腎臟形態(tài)改變的觀察：在與各相應(yīng)的正常參數(shù)對(duì)照之下，了解中毒家兔腎功能的改變：進(jìn)而根據(jù)各實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)，判斷、分析致病因素及導(dǎo)致急性腎衰的可能發(fā)病機(jī)制。

3.通過(guò)利尿劑的應(yīng)用，觀察對(duì)急性腎功能衰竭動(dòng)物模型的治療效果，并分析其可能的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)原理

腎臟是一個(gè)多功能器官，最主要的功能是泌尿。腎臟通過(guò)調(diào)節(jié)腎血流、腎小球?yàn)V過(guò)率、腎小管排泄與重吸收，排泄體內(nèi)代謝物質(zhì)以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。動(dòng)脈血壓、血容量、腎內(nèi)自身調(diào)節(jié)與一些神經(jīng)體液調(diào)節(jié)因素，可影響腎臟尿液生成。當(dāng)腎血流量減小，腎小球?yàn)V過(guò)率下降或腎小管排泄重吸收功能障礙時(shí)，腎的泌尿功能受到影響，從而導(dǎo)致腎功能不全。通過(guò)對(duì)此三方面的檢測(cè)以及尿常規(guī)和腎形態(tài)的觀察可以判斷腎功能狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 

家兔2-3kg，2只/組

藥物、器械  

1％HgCl₂、0.95 NaCl、25%烏拉坦、0.6%酚紅、1％速尿、1：10，000腎上腺素、20％葡萄糖、4％磺柳酸、10％NaOH、2%焦銻酸鉀；家兔急性實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械一套、注射器、試管、加樣器、721分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)等。

實(shí)驗(yàn)步驟

復(fù)制模型：于實(shí)驗(yàn)前一天，取兩只家兔，稱重，一只皮下或肌肉注射1％HgCl₂（0.8～1.0ml/kg)造成急性腎功能衰竭，為實(shí)驗(yàn)組兔；另一只皮下或肌肉注射等量的生理鹽水（1.0ml/kg)做為對(duì)照組兔。24小時(shí)后，比較升汞中毒家兔及正常家兔的一般狀態(tài)、活動(dòng)情況與尿量。

一、正常家兔組操作

1、取正常家兔一只。稱體重后，由耳緣靜脈注射3%戊巴比妥1.0ml/kg或25%烏拉坦4.0 ml/kg，待動(dòng)物麻醉后，固定于兔臺(tái)。先分離頸總動(dòng)脈，穿2線備用。結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在近心端上動(dòng)脈夾（二者應(yīng)有2~3cm距離用以插管)。提起遠(yuǎn)心線端，用眼科剪剪一V字形小口，插入硅膠管，用備用絲線固定。打開動(dòng)脈夾，由頸總動(dòng)脈放血3~5 ml 置一干燥試管中，用備用絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈。血標(biāo)本放置10min后，3000轉(zhuǎn)/分離心15min， 小心吸取血清置于另一干燥試管中，按試劑盒的方法測(cè)血肌酐。

2、剪去下腹部正中兔毛，在恥骨聯(lián)合上約1.5cm 處作切口，長(zhǎng)約4cm，暴露膀胱，將注射器注射針頭刺入膀胱，收集2ml尿液進(jìn)行尿生化測(cè)定和尿常規(guī)檢查。

3、將膀胱翻至體外，于膀胱底部找出兩側(cè)輸尿管。認(rèn)清兩側(cè)輸尿管在膀胱的開口部位，小心從兩側(cè)輸尿管下方穿一絲線，在膀胱頂部血管較少處剪一小口，插入膀胱導(dǎo)尿管至輸尿管開口處，用線將尿道和其它膀胱組織(輸尿管除外)結(jié)扎，通過(guò)導(dǎo)尿管收集尿液。

4、影響尿生成的因素：

（1)記錄正常家兔5min 尿量；

（2)快速iv 37℃生理鹽水20ml，然后記錄5min尿量；

（3)iv 20%葡萄糖5 ml，然后記錄5min尿量；

（4)iv 1∶10 000腎上腺素0.3ml，然后記錄5min尿量。

5、酚紅排泄率測(cè)定與尿液取樣測(cè)定尿肌酐濃度

（1)耳緣靜脈注射 0.6% 酚紅溶液1ml/kg，接著iv 20%葡萄糖3.0 ml/kg，收集從開始注射酚紅起15min 的尿液，換算成單位時(shí)間的尿量（ml/min)。

（2)取0.1ml尿液置于干凈試管中，供測(cè)定尿肌酐用（測(cè)定方法參照試劑盒)。并按下列公式計(jì)算肌酐清除率

肌酐清除率=[尿肌酐濃度（mg/ml)′每分鐘尿量（ml)]/ 血漿肌酐濃度（mg/ml)

（3)用比色法測(cè)定酚紅排泄率：將15min收集的尿液倒入500ml量筒內(nèi)，加10%NaOH10ml，用自來(lái)水補(bǔ)充至500ml處，混勻后，取出適量倒入口徑與比色列相同的試管內(nèi)，再與標(biāo)準(zhǔn)比色列比較，得出15min腎臟酚紅排泄率。

6、形態(tài)學(xué)觀察：處死家兔，取出腎臟，稱腎的重量，計(jì)算腎/體重比，觀察腎臟外形，縱向剖開腎臟，觀察皮髓質(zhì)條紋、色澤等。

7、尿液常規(guī)檢查：取家兔第一次收集的尿液，進(jìn)行尿蛋白質(zhì)測(cè)定和顯微鏡檢查（細(xì)胞、管型)。

（1)尿蛋白測(cè)定：取少量尿液滴于玻片上，加4%磺柳酸一滴，觀察混濁與否及程度判斷尿蛋白的含量。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：

“—”尿液清晰不混濁；

“+”表示尿液出現(xiàn)輕度白色混濁（含蛋白質(zhì)0.01~0.05g%)；

“++”表示尿液稀薄乳樣混濁（含蛋白質(zhì)0.05~0.2g%)

“+++”表示尿液乳濁或有少量絮片存在（含蛋白質(zhì)0.2~0.5g%)

“++++”表示尿液出現(xiàn)絮狀混濁（含蛋白質(zhì)>0.5g%)

（2)尿液鏡檢：取少量尿液滴于載玻片上，鏡下觀察細(xì)胞及管型，細(xì)胞至少檢查10個(gè)高倍視野，管型至少檢查10個(gè)低倍視野上，用最低至最高數(shù)報(bào)告。

二、腎功能不全組家兔操作