病原生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):醫(yī)學(xué)微生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)指導(dǎo)

（供醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、影像、口腔、麻醉、預(yù)防等專業(yè)使用)

廣州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室

目  錄

實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求--------------------------------------------------------------------------2

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則--------------------------------------------------------------------------------2

實(shí)驗(yàn)一  細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)菌的接種培養(yǎng)-----------------------------------------3

實(shí)驗(yàn)二  細(xì)菌的分布和變異-----------------------------------------------------------9

實(shí)驗(yàn)三  消毒滅菌和細(xì)菌的致病性-------------------------------------------------11

實(shí)驗(yàn)四  病毒的形態(tài)和檢查法-------------------------------------------------------21

實(shí)驗(yàn)五  呼吸道感染的細(xì)菌----------------------------------------------------------30

實(shí)驗(yàn)六  消化道感染的細(xì)菌(1)------------------------------------------------------33

實(shí)驗(yàn)七  消化道感染的細(xì)菌(2)------------------------------------------------------33

實(shí)驗(yàn)八  創(chuàng)傷感染的細(xì)菌-------------------------------------------------------------37

實(shí)驗(yàn)九  性感染和輸血感染的微生物----------------------------------------------40

實(shí)驗(yàn)十  真菌實(shí)驗(yàn)----------------------------------------------------------------------45

附錄一  染色液及染色法-------------------------------------------------------------48

附錄二  試劑及溶液-------------------------------------------------------------------50

附錄三  常用培養(yǎng)基制備-------------------------------------------------------------51

附錄四  真菌小培養(yǎng)法----------------------------------------------------------------56

實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵��?/b>

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的重要組成部分，是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教學(xué)過程中的重要環(huán)節(jié)之一，是理論與實(shí)驗(yàn)研究的技術(shù)基礎(chǔ)。

通過實(shí)驗(yàn)，加深、鞏固對理論內(nèi)容的理解與記憶；學(xué)習(xí)、掌握有關(guān)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的基本操作技術(shù)，樹立無菌操作觀念；更重要的是通過實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)實(shí)事求是的科學(xué)的態(tài)度和獨(dú)立分析問題與解決問題的能力。為對有關(guān)疾病的診斷與防治，對醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的科學(xué)研究工作所必要的實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)打下一定的基礎(chǔ)。特別是通過實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生熟練地掌握普通光學(xué)顯微鏡、涂片染色、分離接種與稀釋方法等基本操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)形式分教師示教和學(xué)生操作兩種。前者主要驗(yàn)證理論，后者可從不同角度進(jìn)行基本技術(shù)訓(xùn)練和反復(fù)練習(xí)，掌握基本技能。

為了提高實(shí)驗(yàn)課效果，保證實(shí)驗(yàn)課質(zhì)量，要求學(xué)生做到：

⒈實(shí)驗(yàn)前必須做好預(yù)習(xí)，以了解實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容、目的、理論依據(jù)、操作方法及注意事項(xiàng)，避免或減少錯誤的發(fā)生。

⒉實(shí)驗(yàn)過程中堅持嚴(yán)肅性，嚴(yán)格性與嚴(yán)密性，對操作的實(shí)驗(yàn)要在全面理解的基礎(chǔ)上，按步驟依次進(jìn)行操作，并進(jìn)行積極地思考；對示教內(nèi)容要仔細(xì)觀察并與有關(guān)理論密切聯(lián)系。

⒊如實(shí)記錄，分析結(jié)果，得出結(jié)論。如結(jié)果與理論不符，應(yīng)盡量分析，探討起原因以培養(yǎng)訓(xùn)練自己的思維能力，最后寫出實(shí)驗(yàn)報告。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

實(shí)驗(yàn)中所用材料，多具有傳染性（如病原微生物、含病原微生物的患者血、尿、便、痰、膿汁及感染動物等)，在實(shí)驗(yàn)過程中，必須嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行無菌操作，以保證結(jié)果準(zhǔn)確，防止實(shí)驗(yàn)室感染，防止病原微生物污染環(huán)境。必須遵守以下各項(xiàng)。

一、進(jìn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)穿白大衣，不得將書包、衣物等放在實(shí)驗(yàn)臺上，不必需的物品勿攜入室內(nèi)。

二、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁飲食、吸煙及用嘴舔濕鉛筆及瓶簽等。

三、保持實(shí)驗(yàn)室安靜，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時不準(zhǔn)隨意進(jìn)出。實(shí)驗(yàn)室中物品未經(jīng)許可不準(zhǔn)帶出室外。

四、如發(fā)生感染或污染等意外時，應(yīng)立即報告指導(dǎo)老師，進(jìn)行緊急處理。

⒈吸入活菌液，應(yīng)立即吐入容器中消毒，并用1：1000過猛酸甲溶液或3%雙氧水漱口，必要時根據(jù)菌類的不同服用適當(dāng)?shù)目咕�藥物�?/p>

⒉菌液流灑桌面或地面，傾注2—3%來蘇兒或0.1%新潔爾滅于污染面上，30分鐘后抹去。手上污染活菌，在上述消毒液中浸泡10—20分鐘后，再以肥皂水刷洗。衣服污染時，用上述消毒液浸泡30分鐘后，或高壓滅菌后清洗。

五、實(shí)驗(yàn)用過的吸管、平皿、毛細(xì)管及玻片等應(yīng)立即放入指定的回收桶中，不準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)臺上亂放。接種環(huán)和接種針等用后應(yīng)立即于酒精燈火焰上燒灼滅菌。

六、實(shí)驗(yàn)完畢，應(yīng)及時清理實(shí)驗(yàn)臺，值日生負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室清潔并將回收桶及實(shí)驗(yàn)動物送回消毒室。

實(shí)驗(yàn)一   細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)和接種培養(yǎng)

一、細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

1．認(rèn)識與記憶細(xì)菌的基本形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

各種細(xì)菌在一定條件下，均維持一定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。細(xì)菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)是鑒別細(xì)菌種類的根據(jù)之一，細(xì)菌結(jié)構(gòu)又與其致病性強(qiáng)弱，免疫發(fā)生機(jī)理均有一定關(guān)系。

（二)實(shí)驗(yàn)材料

１、顯微鏡

２、觀察標(biāo)本

（１)球菌、葡萄球菌、鏈球菌、卡他球菌涂片標(biāo)本

（２)桿菌：大腸桿菌涂片標(biāo)本

（３)弧菌：霍亂弧菌涂片標(biāo)本

（４)莢膜：肺炎雙球菌或產(chǎn)氣莢膜莢膜桿菌涂片標(biāo)本

（５)鞭毛：傷寒桿菌或變形桿菌鞭毛標(biāo)本

（６)芽胞：破傷風(fēng)桿菌芽胞標(biāo)本

（三)實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

在玻片標(biāo)本的正面，滴加鏡油，用油鏡觀察。

１、注意觀察細(xì)菌基本形態(tài)（１、２、３、號標(biāo)本)，比較其形狀、大小排列及染色性。

２、注意六別細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)。

（１)觀察４號標(biāo)本莢膜的特點(diǎn)，如大小、顏色與菌體的關(guān)系。

（２)觀察５號標(biāo)本鞭毛的特點(diǎn)，如鞭毛的形態(tài)，數(shù)目及其位置。

（３)觀察６號標(biāo)本芽胞，注意芽胞的形狀、顏色及位置。

３、左眼觀察標(biāo)本的同時，右眼將圖畫在實(shí)驗(yàn)報告紙上，并加以適當(dāng)?shù)孛枋觥?/p>

（四)實(shí)驗(yàn)報告

圖示細(xì)菌基本形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)，并加以適當(dāng)描述。

二、細(xì)菌動力顯微鏡檢查法

細(xì)菌鞭毛與其動力有關(guān)，有無鞭毛，細(xì)菌的運(yùn)動方式不同，依其運(yùn)動特點(diǎn)可間接有判定細(xì)菌有無鞭毛，也是鑒定細(xì)菌方法之一。證明細(xì)菌有無鞭毛，除顯微鏡直接觀察其運(yùn)動特點(diǎn)外，還可以通過鞭毛染色法直接觀察有無鞭毛及其特點(diǎn)，也可以通過半固體穿刺培養(yǎng)法間接證明。本實(shí)驗(yàn)介紹的方法中，以壓滴法最簡單，較為常見。

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

了解細(xì)菌動力的顯微鏡檢查法，觀察有鞭毛與無鞭毛菌運(yùn)動的特點(diǎn)。

有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動稱真正運(yùn)動叫固有運(yùn)動，其特點(diǎn)是細(xì)菌從一個地方游到另一個地方，可以改變位置，無鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動叫布朗運(yùn)動，特點(diǎn)是，不能改變位置，只在局部閃動，是因液體分子的沖擊，致使細(xì)菌在局部顫動，這種運(yùn)動也稱分子運(yùn)動。

（二)實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一)懸滴法

１、材料

（１)菌種：變形桿菌、葡萄球菌８－１２小時幼齡培養(yǎng)物。

（２)凹玻片、蓋玻片、凡士林。

（３)顯微鏡

圖1 懸滴法（正面及側(cè)面)

２、方法

（１)取潔凈凹面玻片一張，在凹窩周圍涂以凡士林（圖２)

（２)取一環(huán)變形桿菌或葡萄壞菌培養(yǎng)物，放于干凈的蓋玻片中央。

（３)將涂凡士林的凹面載物片反轉(zhuǎn)（凹向下)，凹窩對準(zhǔn)蓋玻片的菌液滴置于其上，粘住蓋玻片后再反轉(zhuǎn)凹面載片（此時液滴懸于蓋玻片下)用接種環(huán)柄輕壓蓋片周圍，使與凹窩邊緣粘緊。

（４)凹面載片置于鏡臺上，先以低倍物鏡觀察（聚光器下降，使視野稍暗)找到液滴邊緣后，將邊緣移到視野中央，再換高倍物鏡觀察，上下轉(zhuǎn)動微螺旋，即可看到在較暗的視野中有反光較強(qiáng)的閃動或流動的菌體。

３、結(jié)果

變形桿菌有鞭毛，有改變位置的運(yùn)動，即真正運(yùn)動。

葡萄壞菌無鞭毛，只在局部閃動，即布郎運(yùn)動。

三、 細(xì)菌的革蘭染色標(biāo)本檢查法

形態(tài)學(xué)檢查是鑒定細(xì)菌的重要一環(huán)。但細(xì)菌個體小，無色透明，不染色在鏡下不易觀察清晰，使菌體著色后，即可在鏡下清晰地觀察其形態(tài)特征，有助于菌種的鑒定。進(jìn)行細(xì)菌染色時因共等電點(diǎn)低（PH2~5)，常用美蘭、復(fù)紅、結(jié)晶紫等堿性染料，易于著色。染色方法有單染色與復(fù)染色之分只用一種染料使細(xì)菌著色的方法稱單染色法，用二種以上染料染色的方法叫復(fù)染色法，主要有革蘭氏染色法、抗酸染色法，此外還有多種特殊染色法。

（一)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備法及革蘭氏染色方法。

革蘭氏染色原理尚未完全明了，可能與下述三個方面有關(guān)：

（1)革蘭氏陽性菌等電點(diǎn)（PH2~3)比陰性菌等電點(diǎn)（PH4~5)低，一般染色時深液的酸鹼度在PH7.0左右，故陽性菌較陰性菌帶有較多的陰電荷，與鹼性染料結(jié)合力較強(qiáng)，結(jié)合的染料較多，不易脫色。（2)革蘭氏陽性菌細(xì)胞內(nèi)有某種特殊的化學(xué)萬分，一般認(rèn)為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與染料——媒染劑復(fù)合物相結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易脫色。（3)革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁通透性低，脫色劑（酒精)較易通過革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁，將碘和染料的復(fù)合物溶解洗出，容易脫色，陽性菌則不易脫色，保留了紫色。

（二)實(shí)驗(yàn)材料

1、菌種：大腸桿菌和葡萄球菌的混合液。

2、染液：革蘭氏染色液

3、顯微鏡、載物玻片及接種環(huán)等

（三)實(shí)驗(yàn)方法

1、染色涂片制備法：涂片厚薄適度，否則效果不好。

（1)涂片：取潔凈載物玻片一張，點(diǎn)燃酒精燈，左手持菌液試管右手以持手筆方式拿接種環(huán)，在火焰外焰中燒灼滅菌后取混合菌液一環(huán)，輕輕涂布于玻片的偏中央，涂布范圍直徑1厘米左右，厚度適宜均勻（以透過涂面能看清字跡為宜)。接種環(huán)于火焰上再次燒灼滅菌后放還原處。

（2)干燥：涂片最好在空氣中自然干燥，如欲加速干燥，可將涂面向上，距火焰稍遠(yuǎn)處烘干，切忌緊靠火焰，以防菌體變形，無法觀察。

（3)固定：涂片干燥后，涂面向上在火焰最熱部分往返通過三次（一般鐘擺速度)即可。固定的目的是殺死細(xì)菌，使菌體蛋白凝固與玻片粘附較牢；改變對染料的通透性（一般染料難于進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi))容易著色。

2、革蘭氏染色法

①初染：在已固定好的涂片上滴加結(jié)晶紫液1—2滴（以蓋滿涂面為度)，染1分鐘后，用水輕輕沖洗。

②媒染：革蘭氏碘液1—2滴，作用1分鐘后，水洗。

③脫色：滴加95%酒精2—3滴，輕輕側(cè)動玻片（以助脫色)，使酒精流去，再滴加酒精，如此反復(fù)，直到流下的酒精無色或呈淡紫色為止，水洗。

④復(fù)染：滴加稀釋復(fù)紅1—2滴，染色1分鐘，水洗。

⑤待干或用濾紙吸干（一定要吸干！)用油鏡觀察。

3、實(shí)驗(yàn)報告：繪圖并進(jìn)行分析。

四、 細(xì)菌的接種

（一)細(xì)菌分離培養(yǎng)接種法——平板劃線分離培養(yǎng)法

自然界中，病人被檢材料（痰、便、膿汁及病灶)中常有多種細(xì)菌混雜在一起，欲證明材料中有無某種細(xì)菌存在或?qū)ｉT研究其中某一種細(xì)菌時，必須先使各種細(xì)菌分散開后，方能獲得某種單一細(xì)菌的培養(yǎng)物，這種技術(shù)稱為分離培養(yǎng)接種技術(shù)。方法有多種；如平板劃線法，平板傾注法及動物接種分離法等，前者最為多用。

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

初步練習(xí)平板劃線分離細(xì)菌的方法。使用混雜在一起的細(xì)菌分散生長。

將粘有混雜菌材料的接種環(huán)，從平板培養(yǎng)基表面的一點(diǎn)開始反復(fù)而不重疊地劃線，隨著劃線的延長，接種環(huán)上粘有的細(xì)菌逐漸減少，至劃線的最后部分細(xì)菌可單個地留在培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單個菌落。

2、實(shí)驗(yàn)材料

（1)菌種：白色葡萄球菌和大腸桿菌的混合液。

（2)普通瓊脂平板培養(yǎng)基，接種環(huán)等。

3、實(shí)驗(yàn)方法

（1)右手持接種環(huán)在火焰上滅菌待冷（約2~5秒鐘)取一環(huán)菌液。

（2)左手抓握平板培養(yǎng)基，微開皿蓋，伸入接種環(huán)將材料涂于培養(yǎng)基“甲”部（圖2—1，2—2)。

圖2-1平板區(qū)劃線法 圖2-2陪養(yǎng)后菌落的散布情況

（3)燒灼接種環(huán)冷卻后，通過“甲”部左右反復(fù)劃線（不重疊)并向下移，至培養(yǎng)基一半的地方如圖“乙”部。

（4)再燒灼接種環(huán)待冷，將培養(yǎng)基逆時針轉(zhuǎn)90度，接種環(huán)通過“乙”部，再劃線至培養(yǎng)基所余的一半，如圖“丙”部。

（5)如上法滅菌，將培養(yǎng)基再逆時針轉(zhuǎn)90度，通過“丙”部反復(fù)劃線，劃完最后的“丁”部。

（6)劃完，蓋好皿蓋，并在皿底部貼好標(biāo)簽，說明接種者班組、姓名，培養(yǎng)皿倒置，送溫箱中培養(yǎng)。

（7)37℃24小時后取出，觀察菌落的大小、形狀、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、顏色、透明度等性狀。

（二)細(xì)菌純培養(yǎng)接種法

細(xì)菌分離成純種培養(yǎng)后，常需接種至各種有關(guān)培養(yǎng)基，以進(jìn)一步測試其生化瓜等生物學(xué)性狀。根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)不同，純種接種法有斜面培養(yǎng)基接種、液體培養(yǎng)基接種和穿刺接種法三種。

1、 斜面培養(yǎng)基接種法；主要用于純培養(yǎng)及保存菌種。

（1)實(shí)驗(yàn)材料：

①菌種：大腸桿菌和白色葡萄球菌18~24小時液體培養(yǎng)物。

②培養(yǎng)基：瓊脂斜面培養(yǎng)基。

   （2)實(shí)驗(yàn)方法：

圖3  斜面培養(yǎng)基接種法

①左手拇指、食指、中指及無名指握住菌種管或待接種的培養(yǎng)基管使菌種管底部，斜面向上。

②右手持接種環(huán)，燒灼滅菌，柄部也要迅速通過火焰2~3次殺滅表面的雜菌，滅菌后拿在手中，勿與其它物接觸。

④以右手小指和小魚際肌拔取菌種管或待接種管橡皮塞，管口迅速通過火焰滅菌。

⑤用滅菌后冷卻的接種環(huán)伸入菌種管取菌一環(huán)。自待接種管斜面底部輕輕向上部蜿蜒劃線或在斜面作上下涂布（勿觸破培養(yǎng)基表面，沾菌的接種環(huán)進(jìn)出試管時不應(yīng)觸及試管內(nèi)壁和管口)。

⑥接種畢，接種環(huán)火焰滅菌后放下。管口迅速通過火焰2~3次滅菌并塞上橡皮塞，將管放回原處。

⑦37℃孵育18~24小時，觀察生長情況。

2、 液體培養(yǎng)基接種法：主要用于增菌培養(yǎng)及檢測細(xì)菌的生化反應(yīng)。

（1)實(shí)驗(yàn)材料：

①菌種：大腸桿菌18~24小時斜面培養(yǎng)物。

②培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基。

（2)實(shí)驗(yàn)方法

①如斜面培養(yǎng)基接種法，左手握持菌種管或待接種管。

②接種環(huán)火焰滅菌，伸入菌種管取少量菌苔，再伸入肉湯管中在接近上面液面管壁上輕輕研磨（圖4)并沾取少許肉湯調(diào)和，使菌混于肉湯中。

③接種畢，接種環(huán)滅菌后放下。分別塞好橡皮塞（方法同前)37℃孵育18~24小時，觀察生長情況。

圖4  液體培養(yǎng)基接種法

3、半固體培養(yǎng)基接種法

制成呈柱形直立于試管中的半固體培養(yǎng)基，應(yīng)用穿刺法接種。

（1)實(shí)驗(yàn)材料

①菌種：大腸桿菌及白色葡萄球菌18~24小時斜面培養(yǎng)物。

②培養(yǎng)基：半固體瓊脂培養(yǎng)基

③接種針

（2)實(shí)驗(yàn)方法

①左手握持菌種管或待接種管（方法同前)

②右手持接種針火焰滅菌，挑取少許菌苔，于待接種培養(yǎng)基中心垂直插入（圖5)近管底處，然后轉(zhuǎn)動接種針原路退出。

圖5  半固體培養(yǎng)基接種方法

③接種畢，接種針滅菌后放下，分別塞好橡皮塞。37℃孵育18~24小時，觀察有無細(xì)菌生長，細(xì)菌有無動力。

（四)實(shí)驗(yàn)報告

記錄普通瓊脂平板、斜面、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果。說明有何實(shí)際意義。

實(shí)驗(yàn)二   細(xì)菌的分布和變異

  一、細(xì)菌的分布

（一)自然沉降法――檢查空氣中的細(xì)菌

    1．實(shí)驗(yàn)材料：普通瓊脂平板。

2．實(shí)驗(yàn)方法：

取普通瓊脂平板一個，打開皿蓋，讓培養(yǎng)基直接暴露于空氣中，置于實(shí)驗(yàn)臺上或需要測定的地方10分鐘。蓋上皿蓋，用記號筆或蠟筆作標(biāo)記，放入37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時，觀察細(xì)菌的生長情況和數(shù)量。并分析其意義。

（二)手指皮膚表面的細(xì)菌檢查――涂抹法

    1．實(shí)驗(yàn)材料：普通瓊脂平板。

2．實(shí)驗(yàn)方法：

取普通瓊脂平板一個，在平板底面用記號筆或蠟筆將平板分成若干等份，于每份培養(yǎng)基表面分別用手指輕輕涂抹（不要擦破培養(yǎng)基)。蓋上皿蓋,分別標(biāo)記清楚。置37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的數(shù)量及種類，并分析其意義。

   【注意事項(xiàng)】

本實(shí)驗(yàn)檢出的除細(xì)菌外，尚可能有真菌、放線菌等，請注意加以區(qū)別。

 （三)人咽喉部位的細(xì)菌檢查

1．實(shí)驗(yàn)材料：血液瓊脂平板。

2．實(shí)驗(yàn)方法：

   取血液瓊脂平板一個，打開皿蓋，將培養(yǎng)基面置于口腔前約10厘米處，用力咳嗽數(shù)次（讓飛沫落在培養(yǎng)基表面)，然后蓋上皿蓋。置37℃培養(yǎng)18~24小時觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的數(shù)量、種類等，注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。

二、細(xì)菌的變異

由于細(xì)菌結(jié)構(gòu)簡單、繁殖迅速，易受環(huán)境條件影響而發(fā)生變異。正因?yàn)橛辛俗儺愋裕?細(xì)菌才會有所發(fā)展，產(chǎn)生變種和新種。

細(xì)菌的形態(tài)變異

    應(yīng)用人工的方法，可以導(dǎo)致細(xì)菌的形態(tài)變異。如將鼠疫桿菌培養(yǎng)于含鹽的培養(yǎng)基中， 能使其變異成大小不等的多形態(tài)。

(一)材料：

1、菌種：鼠疫耶爾森氏菌(無毒株)斜面24小時培養(yǎng)物；

2、載玻片、革蘭氏染液、3—6％氯化鈉血液瓊脂培養(yǎng)基。

(二)方法：

1、接種無毒鼠疫耶爾森氏菌于3—6％氯化鈉血液瓊脂斜面上。  

2、28—30℃孵育3天，取出作涂片，革蘭氏染色后在鏡下與未變異前的涂片作比較觀察。

細(xì)菌菌落變異

光滑型→粗糙型菌落變異，是細(xì)菌的—個全面性的變異，不僅其菌落外形不同，在液 體培養(yǎng)基中的生長情況、生化反應(yīng)能力、抗原性及致病性等都會發(fā)生改變。

一)材料：

1、菌種：光滑型、粗糙型痢疾志賀氏菌瓊脂斜面18—24小時培養(yǎng)物；

2、瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基。

(二)方法：

1、分別接種光滑型及粗糙型痢疾志賀氏菌于兩個瓊脂平板上和兩管肉湯中。

2、37℃孵育24小時后，比較觀察兩型的菌落特征及在液體培養(yǎng)基中的生長情況。  

細(xì)菌鞭毛的變異   

若在培養(yǎng)基中加人0.1％的石炭酸，變形桿菌鞭毛的形成就會受抑制。有鞭毛的變形桿菌，動力非�；顫�，在普通培養(yǎng)基可形成特殊的遷徒生長現(xiàn)象(即是從接種處向四周擴(kuò)散生長)，失去鞭毛者，則無此現(xiàn)象。

(一)材料：

1、  菌種：普通變形桿菌瓊脂斜面18—24小時培養(yǎng)物；

2、  瓊脂平板、0.1％石炭酸瓊脂平板培養(yǎng)基。

(二)方法：

1、分別在瓊脂平板和0.1％石炭酸瓊脂平板的一側(cè)點(diǎn)種變形桿菌，勿將細(xì)菌劃分開。

2、37℃孵育24小時后，觀察有無遷徒現(xiàn)象。

 細(xì)菌的耐藥性變異—R因子傳遞試驗(yàn)

大腸埃希氏菌與痢疾志賀氏菌的新陳代謝不同，前者能分解乳糖產(chǎn)酸，在S．S．培養(yǎng) 基中使指示劑(中性紅)顯色，故菌落呈粉紅色，不透明。痢疾志賀氏菌不能分解乳糖，因而在S．S．平板上菌落為無色半透明。若將耐鏈霉素的大腸埃希氏菌與鏈霉素敏感的痢疾志賀氏菌共同孵育，則大腸埃希氏菌可因與痢疾志賀氏菌直接接觸，通過接合使R因子將耐藥性傳遞，可使痢疾志賀氏菌獲得耐鏈霉素的特性。耐鏈霉素的痢疾志賀氏菌可在含鏈霉素的平板上生長繁殖，表現(xiàn)為半透明無色菌落。對這類菌落還需按腸道桿菌必要的鑒定步驟予以鑒定，以明確其是否為耐藥菌株。

(一)材料：

1、菌株：耐鏈霉素的大腸埃希氏菌菌株，對鏈霉素敏感的福氏痢疾志賀氏菌菌株；

2、培養(yǎng)基：普通肉湯培養(yǎng)基，含100p．g鏈霉素／毫升的S．S．平板；S．S．平板；

3、無菌吸管，無菌試管，無菌棉拭子等。

(二)方法：

l、將耐藥的大腸埃希氏菌與敏感的福氏痢疾志賀氏菌分別移種到兩支肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時。

2、吸取1份大腸埃希氏菌培養(yǎng)液加4份痢疾志賀氏茵培養(yǎng)液混合于一無菌試管中； 37℃30分鐘至1小時。 

3、用無菌棉拭子沾取上述混合菌液涂布于含100μg／ml鏈霉素的s.s平板上，同時分別接種福氏痢疾志賀氏菌和大腸桿菌于s.s平板與含鏈霉素的s.s平板上，37℃培養(yǎng)18—24小時后，觀察菌落情況。

實(shí)驗(yàn)三   外界因素對細(xì)菌的影響

  物理因素對細(xì)菌的影響

許多物理因素如溫度、干燥、紫外線、電離輻射和聲波等均可導(dǎo)致細(xì)菌生長繁殖的抑 制、殺滅或變異。本次實(shí)驗(yàn)主要觀察熱力和紫外線對細(xì)菌的殺滅作用，并了解濾菌器的除 菌方法。

一、細(xì)菌對熱的抵抗力

   (一)材料：

大腸埃希氏菌肉湯培養(yǎng)物、枯草桿菌肉湯培養(yǎng)物、小管肉湯、溫度計、燒杯、三腳架、泥三角。

(二)方法：

1、先用酒精燈把燒杯內(nèi)的水加熱煮沸備用。  

2、用接種環(huán)各取大腸埃希氏菌三環(huán)接種于兩管肉湯中，同法接種枯草桿菌到另外兩 管肉湯中。

3、取已接種大腸埃希氏菌、枯草桿菌的肉湯各一管作為試驗(yàn)組，放人盛有沸水的燒杯 中，繼續(xù)加熱維持沸騰5分鐘；然后取出，迅速放人冷水中冷卻，并作好標(biāo)記。

4、余下的接種了大腸埃希氏菌、枯草桿菌的肉湯各一管；不加熱處理，作為對照組(做 好標(biāo)記)。 

5、最后將試驗(yàn)組及對照組肉湯管放37℃溫箱中，孵育24小時后有無細(xì)菌生長，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中比較不產(chǎn)芽胞的大腸埃希氏菌與產(chǎn)芽胞的枯草桿菌對熱的抵抗能力。

  注意事項(xiàng)：

(1)接種前，應(yīng)先將枯草桿菌肉湯培養(yǎng)物充分搖勻，使菌膜破碎、細(xì)菌分散，然后取菌。  (2)試驗(yàn)組需在試管塞上作適當(dāng)標(biāo)記，而不宜在試管壁上用蠟筆做標(biāo)記，以防加熱后標(biāo)記模糊不清。

(3)加熱時間需嚴(yán)格掌握，水沸后才將兩支試管放人，燒杯口的空隙用玻片蓋住，煮沸 維持5分鐘即行取出并迅速置冷水中冷卻。  

二、紫外線對細(xì)菌的作用  

紫外線在波長2000-3000A⁰，具有殺菌能力，但穿透性不強(qiáng)，可被普通玻璃及紙片所 吸收。故紫外線常用于手術(shù)室、無菌室的空氣消毒。 

(一)材料：

大腸埃希氏菌肉湯培養(yǎng)物；  

瓊脂平板一個；

滅菌的三角紙片、鑷子。

(二)方法：

1、用接種環(huán)沾取大腸埃希氏菌菌液兩環(huán)，放于普通平板上，用擴(kuò)散棒來回涂布于整個 平板表面。

2、將鑷子通過火焰滅菌，夾取無菌的三角形黑紙片一張，置于涂菌平板上一側(cè)的1／3處，用平皿玻璃蓋蓋上末放紙片的另1／3處，于紫外線下直接照射30分鐘(如圖4—1)。

3、照射完畢，用火焰滅菌鑷子取出紙片，放入消毒缸內(nèi)，蓋好平板，置37℃溫箱孵育 18—24小時，觀察結(jié)果。

圖6 紫外線對細(xì)菌作用示意圖

 三、高壓蒸汽滅菌(介紹)

  手提式高壓蒸汽滅菌器使用法：

(—)結(jié)構(gòu)與滅菌原理：

手提式高壓蒸汽滅菌器是一雙層筒狀金屬容器(見圖4-2，圖4-3)，兩層之間盛水，外層堅厚，上端有蓋，蓋旁附有螺栓，使用時將螺旋扭緊使蓋緊閉蒸汽不能外溢，蓋上裝有排氣閥門，安全閥門，以調(diào)節(jié)器內(nèi)蒸汽壓力。溫度計、壓力表以表示內(nèi)部溫度和壓力。器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，以盛放欲滅菌的物品。高壓蒸汽滅菌方法的原理是水在大氣中100℃左右沸騰，大氣壓力增加沸騰溫度將隨之增加。因此，在密閉的高壓滅菌器內(nèi)，當(dāng)壓力指示蒸汽壓力增加到每平方英時15磅(１.05kｇ／cm²)時，溫度則相當(dāng)121.3℃，在這種溫度下15—30分鐘即可殺死細(xì)菌的繁殖體與芽胞。

圖7  手提式高壓蒸汽滅菌器 圖8  直立式高壓蒸汽滅菌器

(二)使用方法：  

先將高壓蒸汽滅菌器底層加水，將欲滅菌物品放置在金屬圓筒擱板內(nèi)，然后將蓋緊閉，扭緊螺旋、器底加熱；待器內(nèi)壓力升至5磅時，稍放開排汽閥門約３分種，待壓力下降至0時，使器內(nèi)原來冷空氣完全排出，否則壓力表所示壓力并非全部是蒸汽壓力，滅菌將不完全。待空氣全部排出后，關(guān)閉排氣閥門，繼續(xù)加熱，待壓力升至所需磅數(shù)(一般為15磅)，調(diào)節(jié)熱源，使維持15－30分鐘；滅菌時間到達(dá)后，便停止加熱，待壓力自行下降至0時，開 蓋取物。切勿突然打開排氣閥門放氣減壓，以免液體的物品沖出容器而外溢�！　　　　　　�

四、干熱滅菌法(簡介)

  (一)應(yīng)用：

玻璃器血等在滅菌前經(jīng)洗凈，充分干燥，并經(jīng)適當(dāng)包裝后，放于烤箱內(nèi)滅菌。

  (二)用法：

將物品放人后，閉門加熱(通電)，溫度漸升至160—170℃，保持2小時，即達(dá)滅菌目的。 

  (三)注意事項(xiàng)：

1、溫度不可超過180℃，否則棉塞及包裝紙會被燒焦。

2、滅菌之玻璃器皿事先應(yīng)充分干燥，否則易破裂。 

3、滅菌后，待箱內(nèi)溫度下降至40℃以下時，方可開門。不然，高溫時突然開門，驟然  過冷，可能使玻璃發(fā)生破裂等意外。

五、濾器除菌(介紹)

經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后會變質(zhì)的物質(zhì)如血清、胰蛋白酶、氨基酸及維生素等，可采用此法除菌。除菌濾器種類很多，現(xiàn)以蔡氏(Seitz)EK石棉板濾器為例，了解濾器的使用方法。

這種濾器由金屬漏斗和夾在其中的石棉濾板組成。EK型石棉板(Enkkeimung縮寫, 意為無菌)細(xì)菌不能通過(見圖9)。

圖9 細(xì)菌濾器

  把石棉濾板裝入漏斗，用牛皮紙包扎后以高壓蒸汽滅菌。在使用濾器時打開包紙，取出濾器裝在經(jīng)滅菌的抽濾瓶上。用橡皮管將濾瓶連接裝有氯化鈣的干燥瓶上，干燥瓶另一端 開口處用橡皮管與抽氣泵連接。然后把待濾的懸液注人漏斗內(nèi)，開動抽氣泵進(jìn)行過濾。濾液多時，須邊濾邊加，直到濾完為止。

用過的濾器須用高壓蒸汽滅菌，然后棄去石棉濾板，洗凈金屬濾器、拭干，裝上新的石棉濾板，用牛皮紙包好滅菌以備下次應(yīng)用。

目前國內(nèi)使用的除菌濾器，主要包括Seitz氏濾器和玻璃濾器，用作血清或較濃蛋白 質(zhì)濾過除菌，應(yīng)使用加壓式Seitz氏濾器。這樣可使過濾時不會因產(chǎn)生泡沫等而順利濾 過。玻璃濾器(見圖4—4)為抽濾式，濾板是陶質(zhì)。用于除菌的規(guī)格為C₆較可靠，但不適合血清除菌用。

化學(xué)因素對細(xì)菌的影響

許多化學(xué)物品能使細(xì)菌蛋白變性，妨礙代謝中某些重要酶的活力或破壞細(xì)胞膜等，導(dǎo)致細(xì)菌生長繁殖停頓、甚至死亡。

  影響化學(xué)消毒劑殺滅細(xì)菌的因素很多，與消毒劑的種類、性質(zhì)、濃度，細(xì)菌種類、數(shù)量、 有無芽胞，以及兩者接觸時間長短、溫度高低，環(huán)境中是否有有機(jī)物存在等都有關(guān)。

 一、常用的化學(xué)消毒劑對細(xì)菌的影響

(—)材料：

白色葡萄球菌液(6億／m1)，無菌吸管；

肉湯培養(yǎng)基2ml／支；

2％來蘇，1：1000新潔而滅及生理鹽水。

(二)方法：

用無菌吸管吸0.1毫升白色葡萄球菌液加入下列各管中：生理鹽水(2m1)、2％來蘇 (2m1)、1：1000新潔而滅(2ml)。 

搖勻、靜置一旁，經(jīng)1、5和20分鐘后從各管取出二接種環(huán)分別移種于肉湯培養(yǎng)基。

 二、染料對細(xì)菌的影響  

很多染料具有抑菌的作用，在一般情況下，細(xì)菌都帶陰電，故常用堿性染料作為抑菌劑；又因革蘭氏陽性菌的等電點(diǎn)比革蘭氏陰性菌低，因此，同一種堿性染料，對革蘭氏陽性菌的抑菌作用要比革蘭氏陰性菌大。

(一)材料： 

白色葡萄球菌及大腸埃希氏菌；

龍膽紫瓊脂斜面(含1：100，000的龍膽紫)。

(二)方法：

用滅菌接種環(huán)取大腸埃希氏菌及白色葡萄球菌接種于龍膽紫瓊脂斜面上。置37℃溫箱24小時后觀察結(jié)果。

生物因素對細(xì)菌的影響

在自然界中，除理化因素對微生物的作用外，生物因素即微生物與微生物之間，微生 物與動植物之間也存在各種互相作用的關(guān)系。  

一、抗生素的抗菌作用

有的放線菌、真菌和細(xì)菌能合成抗生素�？股�素具有抑制和殺死其他微生物的作用， 因而常用來防治各種細(xì)菌性傳染病。各種致病菌對抗生素的敏感性不同，即使同—種細(xì) 菌的不同菌株對不同抗生素的敏感性也有差別。在治療中，細(xì)菌對藥物的敏感性也常會 發(fā)生改變，甚至出現(xiàn)耐藥菌株，亦即產(chǎn)生耐藥性變異。因此，測定細(xì)菌對藥物的敏感常用 的方法有紙片彌散法和試管稀釋法(本實(shí)驗(yàn)為紙片彌散法)。  

(一)材料：

普通平板；

大腸埃希氏菌液(6小時肉湯培養(yǎng)物)；

葡萄球菌液(6小時肉湯培養(yǎng)物)；

干燥藥物濾紙片(直徑6毫米)、小鑷子。

每枚紙片的藥物含量為：

青霉素    1單位

鏈霉素    10微克

慶大霉素 10微克

圖10  藥物敏感實(shí)驗(yàn)

（紙片彌散法)

(二)方法：

無菌接種環(huán)取葡萄球菌液2—3環(huán)，放于普通平板上，再用無菌擴(kuò)散棒將菌液均勻涂布于整個平板表面。 

待平板上菌液稍干后，用滅菌鑷子取干燥的藥物濾紙片(按圖6-1)所示位置放于平板上，并在平板背面玻璃上注明藥物名稱。

  同上方法取大腸埃希氏菌液另做一 份。將平板放37℃溫箱24小時后觀察結(jié)果。

(三)結(jié)果：如細(xì)菌對藥物敏感，則含該藥物的濾紙周圍無細(xì)菌生長，無菌生長的地方稱   抑菌環(huán)。如細(xì)菌對該藥物不敏感，則無抑菌環(huán)或抑菌環(huán)直徑較小。細(xì)菌對藥物敏感度之大小，常以抑菌環(huán)直徑之大小表示(量度抑菌環(huán)的直徑時，應(yīng)包括在濾紙片的直徑在內(nèi))。一般的結(jié)果判定可參考下表。

注意事項(xiàng)：

取細(xì)菌涂布平板時，要注意取用6小時培養(yǎng)的幼齡菌。

附錄：干燥藥物小圓片的制備

將直徑為6毫米的小圓濾紙片于15磅高壓蒸汽滅菌20分鐘后烘干，然后將小紙片分裝于滅菌小瓶內(nèi)，每瓶100片，備用。

以無菌蒸餾水將各藥稀釋成以下濃度：青霉素：100單位／毫升，鏈霉素、慶大霉素： 1000微克／毫升。  

取各稀釋藥液1毫升分別加入盛有100片圓濾紙片的小瓶內(nèi)，使浸泡1—2小時，然后將浸藥紙片真空干燥，此種干燥藥紙片保存于4℃冰箱，藥效可維持l—2個月。

二、細(xì)菌素對細(xì)菌的影響(介紹)

細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的一類抗菌物質(zhì)，但作用范圍狹窄，有一定特異性，只對產(chǎn)生細(xì)菌素菌株有近緣關(guān)系的細(xì)菌有作用。

大腸菌素是細(xì)菌素的一種，其基因位于細(xì)菌質(zhì)粒上，稱Col因子。某些大腸埃希氏菌產(chǎn)生的大腸菌素(Colisin)能抑制另—種大腸埃希氏菌的生長。

(一)材料：

帶有ColE2的大腸埃希氏菌菌株；

敏感菌：大腸埃希氏菌K—12，W1485株；

普通平板、肉湯、0.7％半固體瓊脂；

吸管、氯仿。

(二)方法：

1、把產(chǎn)生大腸菌素的大腸埃希氏菌菌株點(diǎn)種于普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。 

2、用氯仿熏上述平板一小時，以殺死點(diǎn)種的大腸埃希氏菌。

3、把敏感菌株接種于肉湯管，37℃孵育12小時，經(jīng)5倍稀釋后，吸0.1ml加于3ml 0.7％半固體瓊脂(約50℃)中，迅速混勻傾注在上述平板上層，待凝固后孵育過夜，觀察結(jié)果。

三、噬菌體特異性溶菌現(xiàn)象    

(一)材料：

大腸埃希氏菌、葡萄球菌18—24小時肉湯培養(yǎng)物；

大腸埃希氏菌噬菌體；

普通平板。

(二)方法：

1、于普通瓊脂平板底，用蠟筆劃兩個直徑約2厘米的圓圈。

2、 用無菌接種環(huán)取大腸埃希氏菌及葡萄球菌液分別涂布于圈內(nèi)，并作好標(biāo)記。

3、待接種的菌液干后，再用滅菌的接種環(huán)取大腸埃希氏菌噬菌體分別點(diǎn)種于涂布有細(xì)菌的圓圈中心上。

4、將平板放37℃孵育24小時，觀察是否有蝕斑出現(xiàn)并記錄結(jié)果。

四、噬菌體效價測定法介紹(試管法)  

(一)材料：    

大腸埃希氏菌6小時肉湯培養(yǎng)物、大腸埃希氏菌噬菌體、肉湯培養(yǎng)基、小試管、吸管。

(二)方法：

1、取無菌小試管10支，排列于試管架上并編號。

  2、每管加肉湯0.9毫升；

3、 加大腸埃希氏菌噬菌體各0.1毫升于第1及第10管，第一管用吸管吸放3次均勻  后，取出0.1毫升至第2管，同法混合后，取0.1毫升至第3管，如此作10倍稀釋，直至第  8管止。最后混勻后，自第8管吸出0.1毫升棄去，第9管不加噬菌體。

4、加大腸埃希氏菌菌液于第1至第9管，每管0.1毫升，第10管不加菌液，搖勻，37℃孵育4—8小時左右。發(fā)現(xiàn)只有細(xì)菌的對照管出現(xiàn)混濁時，觀察結(jié)果，凡能發(fā)生溶菌的噬  菌體最高稀釋度即其效價。

細(xì)菌的致病作用

細(xì)菌的致病力包括侵襲力和毒素。前者是指細(xì)菌的一些酶類及其它表面結(jié)構(gòu)物質(zhì)。  細(xì)菌所產(chǎn)生的侵襲性酶有透明質(zhì)酸酶、鏈激酶、血漿凝固酶等。毒素有內(nèi)、外毒素兩種。通過本實(shí)驗(yàn)了解透明質(zhì)酸酶和外毒素、內(nèi)毒素的致病作用。 

一、透明質(zhì)酸酶(又稱擴(kuò)散因子)試驗(yàn)

(—)材料：

家兔；

乙型溶血性鏈球菌24小時肉湯培養(yǎng)濾液；

黑墨水、生理鹽水及無菌注射器及針頭等。

(二)方法：

1、取家兔—只，將背部兩側(cè)毛剪去(或用脫毛劑將毛脫去)。

2、分別取乙型溶血性鏈球菌24小時肉湯培養(yǎng)物濾液0.5以及鹽水0.5m1，各與等量 黑墨水混合。

3、于家兔．背部一側(cè)皮內(nèi)注射乙型溶血性鏈球菌濾液與黑墨水混合液0.1ml，于另一側(cè)皮內(nèi)注射鹽水與黑墨水混合液0.1m1，作為對照(注射時注意避免漏出；以免使表皮著色，影響結(jié)果的觀察)。 

4、注射后1小時觀察結(jié)果，比較兩側(cè)黑墨水?dāng)U散范圍的大小并記錄之。

二、破傷風(fēng)外毒素的毒性作用    

   (一)材料：

小白鼠；  

破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)物濾液(內(nèi)含破傷風(fēng)外毒素)。

(二)方法：

1、取小白鼠一只,于后腿肌肉注入破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)物濾液0.1ml。

2、次日觀察結(jié)果，可見肌注側(cè)的下肢及尾巴首先強(qiáng)直，并逐漸延及另一側(cè)下肢及全身，1—2日后死亡。

注意事項(xiàng)：

1、注射破傷風(fēng)外毒素時，需提高警惕，小心操作以免發(fā)生意外。 

2、注意外毒素用過的針頭、注射器及沾有外毒素的棉簽，應(yīng)放人指定容器內(nèi)，切勿到處亂放。

三、內(nèi)毒素的致熱作用

(一)材料：

加熱殺死的傷寒沙門氏菌培養(yǎng)液；

肛探體溫計、無菌注射針頭、酒精、棉球、凡士林。

(二)方法：

1、先用體溫計測試家兔體溫，測試方法如下：

1)用酒精棉球消毒體溫計，抹上少量凡土林。

(2)將家兔輕輕抱起放于實(shí)驗(yàn)臺上，將其頭部用手臂夾牢于肘間，用—手提起尾巴，另一手從肛門將體溫計插入。插人時動作要輕，避免動物掙扎而影響體溫。

(3)經(jīng)3分鐘后取出體溫計，用干棉球擦去凡士林，觀察并記錄體溫。

2、用注射器吸取傷寒桿菌液0.5—1毫升注入家兔耳靜脈內(nèi)。

3、注射后經(jīng)30分鐘與60分鐘，再分別測試體溫，觀察是否較前升高。

注意事項(xiàng)：

1、測量家免體溫時動作要輕柔，以免家兔掙扎而影響體溫。

2、體溫計插人家兔肛門時宜先稍向下插入后，再徐徐向上插入。 

動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動物常用作病原微生物的分離，毒力測定，致病作用的研究及免疫血清的制備。在進(jìn)行微生物動物實(shí)驗(yàn)時應(yīng)選擇易感性高、易于喂養(yǎng)、易于獲得和最好能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量繁殖的小動物。所用的動物必須身體健康，若自外購買者應(yīng)隔離一定時間觀察無病才可應(yīng)用，盡可能使用純種，按不同的實(shí)驗(yàn)要求選取不同的動物、一定的體重與年齡。常用的實(shí)驗(yàn)動物為小白鼠、豚鼠、家兔、大白鼠、猴等；大動物則有羊與馬等。

本實(shí)驗(yàn)的目的是練習(xí)常用實(shí)驗(yàn)動物各種接種途徑的操作法。 

一、小自鼠皮下注射法

(一)材料：

小白鼠；

無菌注射器(2m1 )及注射針頭(5號或5.5號)；

碘酒、酒精、無菌生理鹽水。

(二)接種法：

l、用注射器吸取生理鹽水0.5mL。  

2、使小白鼠爬行于桌上，右手牽其尾，則鼠向前急竄，用左手食指及拇指捉其兩耳及頸部皮膚，將手反轉(zhuǎn)使小白鼠腹部向上，把小白鼠之尾及其右后腿夾于左手小指及手掌之  間(見圖11—1)，然后用碘酒及酒精消毒小白鼠腹部皮膚。  

3、注射時，要使局部皮膚繃緊。然后注入0.3ml生理鹽水。

二、白鼠腹腔接種法

(一)材料：

與小白鼠皮下接種法相同

(二)接種法：

圖11—1  小白鼠腹腔接種法

 1、用注射器吸取生理鹽水lml。

 2、捕捉小白鼠使其腹部向上(方法同上)，然后用碘酒和酒精消毒小白鼠腹部皮膚。

 3、注射生理鹽水0.5ml于腹腔內(nèi)(先稍平刺人皮下，然后斜刺人腹腔)(見圖12)。

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三、小白鼠肌肉注射法

(一)材料：

與小白鼠皮下注別法相同。

(二)接種法：

1、用注射器吸取生理鹽水0.5ml。

2、捉小白鼠使其腹部向上(方法同上)，用碘酒、酒精消毒小白鼠左后腿皮膚。

3、注射生理鹽水0.2ml于左后腿肌肉。

 四、家兔靜脈注射法  

(一)材料：

家兔；

無菌注射器(1ml)及注射針頭5.5或6號；

碘酒、75％酒精、無菌生理鹽水、棉花拭子：

(二)方法：

1、家兔置于臺上，固定之。

2、用碘酒消毒耳緣靜脈，然后用75％酒精洗去碘酒并揉擦耳緣靜脈，可使靜脈擴(kuò)張。

3、用注射器吸取生理鹽水0.5ml(如有氣泡應(yīng)驅(qū)盡)，將針頭刺人靜脈內(nèi)輕輕抽吸，見有血回流即注入0.5ml生理鹽水(注入后局部應(yīng)無隆起)(見圖11—2)。

4、注射后，用棉花拭子壓出血處，至血凝固為止(如注射多次，應(yīng)以離耳根遠(yuǎn)處靜脈開始注射，以免靜脈阻塞，影響以后注射)。  

圖11-2．  家兔耳靜脈注射法

五、小白鼠腦內(nèi)接種法

(一)材料同一。

(二)接種法：

   1、用注射器吸取生理鹽水0.3ml(不可超過0.05m1)，用4號針頭。

2、捉小白鼠使其俯臥在桌面上，用碘酒、酒精消毒其眼耳之間皮膚，然后于消毒處將 注射器垂直刺人3mm，注人生理鹽水(見圖11—3)。

六、小白鼠的解剖檢查法

(一)一般解剖檢查：  

1、解剖器械(剪刀、鑷子等)煮沸消毒。

2、將小白鼠置于解剖板上，腹部向上，

伸展四肢，用圖釘釘住四肢。

3、用碘酒及酒精消毒胸部和腹部皮

4、恥骨上緣至胸骨上端之間沿正中線作皮膚剪開，在剪開之上下兩端再向四肢剪開，剝離皮下組織，使皮膚向外翻轉(zhuǎn)。圖11—3

5、檢查皮下組織，腹股溝及腋下淋巴腺。如有腹水，可用注射器或毛細(xì)管刺人 小白鼠腦內(nèi)注射法

腹腔抽出液體，供培養(yǎng)或涂片檢查。

6、從恥骨聯(lián)合到橫膈膜剪開腹腔，由切口上下端橫剪使左右腹膜向外翻轉(zhuǎn)；暴露腹腔  內(nèi)臟，檢查各臟器，取材培養(yǎng)及涂片。

7、剪開胸軟骨，將胸骨翻起，檢查胸部內(nèi)臟，并取材作培養(yǎng)及涂片(如主要病變在胸腔，則可先開胸腔，后開腹腔)。 

8、解剖完畢，將動物先放消毒桶內(nèi)，然后焚化或掩埋，解剖器械可用煮沸消毒。

(二)取腦組織法： 

1、將被剖檢小白鼠自腋下剪開腋下動脈放血致死(目的是減少腦組織的含血量)。然后浸人2％來蘇溶液中片刻，使毛濕透，以免體表寄生蟲及細(xì)菌在解剖時污染腦組織。

2、固定：使背部朝上，頭部涂以碘酒消毒，沿頭部中線剪開皮毛并撥向兩側(cè)，使頭骨暴露。

3、以碘酒消毒頭骨。

4、更換小的剪、鑷，沿頭部周圍剪開頭骨，并剝離之。

5、用弓形小剪把腦組織自腦底部整個挑起，放人無菌平皿內(nèi)備用。

實(shí)驗(yàn)四  病毒的形態(tài)和病毒感染的檢查

病毒的形態(tài)

一、病毒的電子顯微鏡圖的觀察

病毒顆粒很小，常以毫微米(nm)作為測量大小的單位，但外觀上仍具有球形、桿狀、磚形和蝌蚪形幾種基本形態(tài)。利用電子顯微鏡觀察病毒顆粒的負(fù)染色標(biāo)本或含有病毒的細(xì)胞和組織制備的超薄切片標(biāo)本，可以更精細(xì)地觀察各種病毒顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

(一)腺病毒；

   (二)乳頭瘤病毒；

(三)單純皰疹病毒；

  （四)EB病毒；

  （五)痘病毒；

  （六)流感病毒；

(七)輪狀病毒；

(八)甲型肝炎病毒；

二、病毒包涵體的觀察

某些病毒感染后，在宿主細(xì)胞內(nèi)可形成包涵體。一般認(rèn)為包涵體是病毒合成的場所，

也可能是病毒顆粒結(jié)晶的聚集，或是感染細(xì)胞晚期的退化性變化。根據(jù)包涵體形成的部位可分為胞漿內(nèi)或核內(nèi)包涵體；如按染色反應(yīng)則可分為嗜酸性和嗜鹼性包涵體。一種病毒所產(chǎn)生的包涵體是有一定的形態(tài)和部位的，因此包涵體的梭查，對診斷某些病毒性疾病有一走的輔助價值。  

  （一)狂犬病病毒包涵體的觀察：  

狂犬病毒是彈狀病毒屆的一種，可致野生動物及多家畜感染，亦可引起人類狂犬病。  該病毒為RNA型病毒，有血凝特性。病毒在易感動物及人的中樞神經(jīng)細(xì)雄中增殖，形成

胞漿內(nèi)、嗜酸性、圓或橢圓形包涵體，稱內(nèi)基(Negri)氏體。  

一般鏡下所見是大腦海馬回組織切片，經(jīng)HE染色，內(nèi)基氏體于胞漿內(nèi)呈圓或橢圓形

紅色斑塊。

(二)呼吸道合胞病毒包涵體的觀祭：

呼吸道合胞病毒是RNA型的呼吸道常見感染的一種病毒。有包膜而無血凝素結(jié)構(gòu)，能在人和猴的多種細(xì)胞中生長繁殖，感染細(xì)胞形成融合的多核巨細(xì)胞，并產(chǎn)生胞漿內(nèi)圓形的嗜酸性包涵性，一般鏡下所見為人胚腎細(xì)胞的感染標(biāo)本。

(三)腺病毒包涵體：

腺病毒為RNA型呼吸道感染、結(jié)膜及淋巴結(jié)感染的常見病毒。具有血凝特性，能在人胚多種細(xì)胞、猴腎細(xì)胞及腫瘤傳代細(xì)胞中生長繁殖，在感染細(xì)胞核內(nèi)可形成不規(guī)則形狀的嗜鹼性包涵體。

通常鏡下觀察Ⅲ型腺病毒感染HeLa(子宮頸瘤)細(xì)胞所出現(xiàn)的核內(nèi)嗜鹼性包涵體。

病毒的培養(yǎng)

一、病毒雞胚培養(yǎng)法

雞胚培養(yǎng)方法操作簡便，適用于流感病毒、痘病毒、皰疹病毒和腦炎病毒等的培養(yǎng)。

雞胚培養(yǎng)的接種方法有多種，最常用的有：絨毛尿囊膜接種法、羊膜腔接種法、尿囊腔接種法和卵黃囊接種法�？筛鶕�(jù)病毒的特性，選擇適宜的接種途徑。  

(一)受精卵的檢查：

(1)受精卵的選擇，一般健康雞所產(chǎn)，可在產(chǎn)后10天內(nèi)應(yīng)用。

(2)37℃—38℃，相對溫度45—60％為雞胚發(fā)育最適環(huán)境，每天翻動兩次(接種病毒后

溫度應(yīng)為35—37℃)。

(3)孵育后第4天檢卵：

活雞胚一可見清晰的血管，有胚動。

死雞胚一雞胚不動，血管昏暗模糊。

未受精卵一不見雞胚痕跡。

{4)接種前定胚位，在撿卵燈下畫出氣室、胚胎位置及打孔部位。

   (二)觀察雞胚模型圖：

觀察雞胚胎膜型，注意絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵黃囊位置，以上均是病毒接種

的常用部位{見圖12—1}

(三)雞胚卵黃囊接種法：

材料：

雞胚(已孵育6—8天)；

無菌注射器、碘酒、酒精，、錐子。

方法：

(1)取孵育6—8天的雞胚，將氣室及胚位劃出。 

(2)將卵置卵架上，氣室向上。用碘酒、酒精消毒氣室部的卵殼。 

(3)用無菌錐子在氣室部在卵殼中心鉆一小孔，注射器由氣室小孔向胚胎位置相反方

 向、沿卵中軸作20—30度角傾斜刺人約3厘米，即達(dá)卵黃囊內(nèi)，注入被檢材料0．5毫升（見圖27—1)。

(4)拔出針頭，用熔化石蠟封上穿刺孔。

   (四)雞胚絨毛尿囊膜接種法：

材料：

雞胚(已孵育12天)；

牛痘病毒稀釋液；

生理鹽水；

lml無菌注射器、6號針頭、鋸片、解剖刀、毛細(xì)吸管、橡皮吸頭、錐子、小鑷子、剪刀。

方法：

 (1)取已孵育12天之雞胚，將氣室及胚位劃出；，并在胚胎附近找一血管較少的部位劃一個三角形。

(2)碘酒消毒后，以磨牙機(jī)或鋸片沿三角形磨破卵殼但不傷及卵膜，并在氣室部的卵殼正中鉆一孔。

(3)將卵平置架上，用解剖刀輕輕將三角形部位的卵殼揭去，形成卵窗露出卵膜(見圖－12)。

(4)于卵膜當(dāng)中以利針刺破一小縫，以橡皮吸頭自氣室端小孔將氣室中空氣吸出，使絨毛尿囊膜下陷與卵膜分離，而成“人工氣室”。

   (5)將卵膜去掉，即滴人接種材料0.2ml(本次實(shí)驗(yàn)接種牛痘病毒稀釋液)。

(6)迅速將膠布封于三角形卵窗上，以溶化石蠟封閉氣孔。

(7)接種后將雞胚水平放置于37℃孵育48-72小時。

(8)解剖及收獲：將待收獲雞胚卵窗周圍用碘酒消毒，用無菌鑷子擴(kuò)大卵窗，除去殼膜，輕輕夾起絨毛尿囊膜，用小剪沿人工氣室周圍將接種的絨毛尿囊膜全部剪下。天花、牛痘、單純皰疹等病毒在絨毛尿囊膜上，可形成特殊的皰樣改變。

(五)雞胚尿囊腔接種及尿液收取方法：

材料：

9—11天雞胚；

流感病毒；

無菌1ml注射器附6號針頭；

滅菌中試驗(yàn)；

毛細(xì)管、橡皮吸頭、小錐子、小鑷子。

方法： 

(1)取已孵育9-11天之雞胚，置檢卵燈上檢視，將氣室及胚胎位置劃出，在尿囊與氣交界邊緣上0.5—lcm處作一標(biāo)記。

(2)以碘酒消毒該標(biāo)記部位。

(3)以消毒鉆子鉆孔，僅破卵殼勿穿破殼膜(見圖-12)。

(4)將雞胚直立：注射器垂直經(jīng)氣室而穿人約lcm即達(dá)尿囊腔，注射量為0.2ml。

(5)接種后，以熔化石蠟封此小孔，在卵殼上標(biāo)記接種病毒名稱，接種日期。放37℃培養(yǎng)，如接種流感病毒，一般于接種后孵育37'C40—48小時即可收獲。

(6)解剖及收獲：收獲前應(yīng)先將雞胚放4"C冰箱過夜，使其血液凝固，避免收獲時出血。將雞胚直立卵架上，消毒氣室部位蛋殼，用無菌鑷子將殼除去，另用一無菌鑷子撕開殼膜及絨毛尿囊膜。用無菌毛吸管吸取尿囊液(約可得5—6m1)。流行性感冒、腮腺炎、新城雞瘟等病毒都可應(yīng)用雞胚尿囊腔接種進(jìn)行繁殖，并可通過病毒血凝試驗(yàn)加以證明。

(六)雞胚羊水囊接種法：

材料：雞胚(已孵育10—12天)；

無菌注射器、碘酒、酒精、鑷子。

方法：

(1)取孵育10—12天的雞胚，將氣室及胎位劃出。

(2)將卵豎置卵架上，消毒氣室部卵殼。

(3)用磨卵器在氣室部的卵殼上鉆一圓形裂痕，直徑約2cm，細(xì)心地用鑷子除去蛋殼及殼膜，但勿破壞絨毛尿囊膜。

(4)用無菌的鈍尖小鑷子穿過絨毛尿囊膜，輕輕將羊膜夾住并呈傘狀提起，然后用注射針刺入羊膜腔內(nèi)，注入量這0.05—0.1ml(見圖-12)。

(5)用無菌玻璃紙復(fù)蓋氣室打孔處，再用石蠟封閉四周。

圖12 雞  胚  接  種

二、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)（錄像)

   (一)原代細(xì)胞單層培養(yǎng)：

   原代細(xì)胞單層培養(yǎng)法，是指動物(包括脊椎動物和無脊椎動物)的組織自機(jī)體取出后，經(jīng)胰酶或其他細(xì)胞分散劑消化處理，得到單個細(xì)胞懸液，以一定量接種到特定容器中，加入細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)液，置合適溫度中經(jīng)一段時間的培養(yǎng)，分散的單個細(xì)胞即貼附玻壁，開始分裂增殖并逐步長成均勻致密的單層細(xì)胞。組織來源種類很多，如猴腎、地鼠腎、雞胚、人胚腎及蚊子等，本實(shí)驗(yàn)僅通過雞胚單層細(xì)胞培養(yǎng)，了解病毒組織培養(yǎng)的技術(shù)方法。

材料：

雞胚(已孵育9—10天)；

無菌小剪與鑷子；

無菌玻皿用具(包括培養(yǎng)板或培養(yǎng)管、平皿、中試管、漏斗附四層紗布、三角瓶附磁棒、

膠塞、吸管、毛細(xì)吸管等)；

血球計算盤、電磁攪拌器、Hanks液(配法見附錄)；0.5％水解乳蛋白Hank’s液、小牛血清(56℃，30分鐘滅活)，0.25％胰酶、5.6％NaHCO₃抗生素(青霉素1萬iu／ml，鏈霉素1萬iu／ml)。

營養(yǎng)液配制：

小牛血清 5ml

0.5％水解乳蛋白Hank’s液   94ml

抗生素原液  lml

用5.6％NaHC0校正pH為7.4—7.6。

方法： ．

1、，解剖及處理雞胚：

(1)將孵育9天的雞胚以碘酒消毒氣室部位的卵殼后，用無菌小彎鑷子鉤取雞胚置平皿內(nèi)，用小鑷子除去雞胚頭、爪及內(nèi)臟，取其皮膚及骨骼組織，用Hank’s液洗二次，除去殘存血液(洗滌用的Hank’s液需加雙抗，以下同)。

(2)用無菌剪子將雞胚剪碎成0.5—1mm³小塊，加入Hlank’s液3—5ml，轉(zhuǎn)人中試管內(nèi)。 

(3)靜置5分鐘，讓組織塊自然沉降，用毛細(xì)吸管吸除上清，再加入Hank’s液，重復(fù)處理一次。

2、胰蛋白酶消化： 

(1)按每雞胚5ml用量算，加入0.25％胰酶液，置37℃水浴箱中消化半小時。

(2)吸除胰酶液，再按上法用Hank’s液洗滌組織塊二次，以除去剩余的胰蛋白酶溶液。

3、分散細(xì)胞：

  加入5ml培養(yǎng)液，并將組織塊移人附有磁棒的小三角瓶中，置電磁攪拌器上攪拌10分鐘，使雞胚組織塊的細(xì)胞盡量分散，然后用四層紗布過濾，獲得分散的雞胚組織細(xì)胞懸液。

4、細(xì)胞計數(shù)： 

  吸出少許細(xì)胞懸液，滴入血球計算盤內(nèi)，計細(xì)胞數(shù)。

5、細(xì)胞分裝及培養(yǎng)：

  按計算所得的細(xì)胞數(shù)，用營養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成100萬細(xì)胞／ml，接種40孔聚苯乙烯量培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)管，40孔板每孔分裝0.1ml(含10萬細(xì)胞)，加蓋蓋好，靜置平放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞管每管分裝0.7ml(含70萬細(xì)胞)，用膠塞塞緊，靜置斜放使與平面成5⁰角，置37℃溫箱中培養(yǎng)24—48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，置低倍鏡下可見生長成單層的雞胚成纖維細(xì)胞，(見圖-12)。

(二)病毒接種及病毒對細(xì)胞致病作用的觀察：

在低倍鏡下，選擇生長致密成單層的細(xì)胞培養(yǎng)管或40孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸去營養(yǎng)液；培養(yǎng)管每管加0.1ml(細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入0.025m1)的新城雞瘟病毒液，分別置37℃溫箱或CO²培養(yǎng)箱中使病毒吸附30分鐘，然后吸除病毒接種物，加入維持液，每管0.7ml或每孔0.2m[(含1％小牛血清的0.5％水解乳蛋白Hank’s液。其他成分同營養(yǎng)液)，置37℃培養(yǎng)。每天取出，在低倍鏡下觀察有無細(xì)胞病變出現(xiàn)(細(xì)胞變圓，堆積及脫落)。注意要與不接種病毒的細(xì)胞對照作比較。

病毒紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)

某些病毒如粘病毒(流感病毒)、疽病毒(牛痘病毒)、蟲媒病毒(乙型腦炎病毒)、腸道病毒(�？刹《�)表面有糖蛋白，在一定條件下，能與動物紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體相結(jié)合而形成凝集，此即為病毒紅細(xì)胞凝集(HA)。利用HA可以檢測培養(yǎng)物中某些病毒的存在，滴定病毒的血凝效價，并可粗略估計病毒顆粒的數(shù)量(1個血凝單位≈10⁶病毒顆粒)。

若血清中特異性抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合后，使病毒失去凝集紅細(xì)胞的能力而出現(xiàn)抑制血凝現(xiàn)象(HAI)。利用HAI可檢測血清中血凝抑制抗體的存在并測出效價。臨床上，分別測患者發(fā)病早期和恢復(fù)期血清抗體效價，對輔助診斷一些病毒感染有一定意義。

一、病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

（—)材料：

流感病毒雞胚培養(yǎng)尿囊液； ·

流感病毒血凝素(每0．2ml含4單位)

流感病人早期及恢復(fù)期血清；

20孔凹窩塑料板、lml吸管、1％雞紅細(xì)胞懸液；

生理鹽水、橡皮吸頭。

(二)方法：

(1) 取一塊洗凈晾干的20孔凹窩扭料板，用蠟筆做好標(biāo)記。用帶有橡皮吸頭的吸管，于1—9孔內(nèi)各加入生理鹽水0.2ml，在第1孔內(nèi)加入已經(jīng)稀釋成1：5的流感病毒尿囊液0．2ml，混勻后吸出0．2ml至第2孔，再混勻后吸0.2ml至第3孔，如此稀釋到第8孔(病毒稀釋度即分別為1：10—1：1280)，自第8孔吸出0．2ml棄去，第9孔不加流感病毒尿囊液作紅細(xì)胞對照。

(2)每孔加入1％雞紅細(xì)胞0.2ml，搖勻置室溫45分鐘。

(3)觀察結(jié)果時，直接觀察塑料板孔內(nèi)的紅細(xì)胞凝集式樣(見圖29—1)，判斷結(jié)果并作記錄。

最高病毒稀釋度呈“++”凝集者作為病毒的紅細(xì)胞凝集滴度，亦即1個血凝單位。例如： 1：320為“++”，即為1個血凝單位，在紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中；病毒血凝素需用4個單位，按上例1個血凝單位為1：320，則1：80含病毒的尿囊液即為4個血凝單位。

(三)注意事項(xiàng)：

1、用反復(fù)吹吸法稀釋混勻病毒或血清時，手法要輕、穩(wěn)，盡量減少氣泡出現(xiàn)。

2、為了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確，加紅細(xì)胞時，應(yīng)從最后一孔，起向前加。

3、加樣畢，可將塑料板放光滑臺面上慢慢劃圈搖勻，但要防止濺出。

4、觀察結(jié)果時，塑料板底部墊上白紙，減少移動并按時觀察。若延續(xù)時間太長，可能會出現(xiàn)病毒凝集紅細(xì)胞后再離解的現(xiàn)象，因而影響結(jié)果。

圖13  病毒紅細(xì)胞凝集示意圖

  二、病毒紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)

(1)取干凈凹窩塑料板一塊，用蠟筆做好標(biāo)記。用帶有橡皮吸頭的吸管，于第2至第9孔內(nèi)加人生理鹽水0．2ml。

(2)于第1、第2及第9孔中各加入稀釋成1：5的流感病人發(fā)病早期血清0．2ml(血清處理見附錄)，混勻后，從第2孔吸出0．2ml加入第3孔，按同法稀釋至第8孔，吸出0．2ml棄去(血清稀釋度分別為1：5-1：640)。

(3)在第1至第8孔中，各加入4單位流感病毒血凝素0．2ml，第9孔不加，作為血清對照。

(4)取同一病人的恢復(fù)期血清標(biāo)本—份，按同法作紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。

(5)另取兩孔，分別作病毒血凝素對照和紅細(xì)胞對照。第10孔，病毒血凝素對照：鹽水0.2ml+4單位流感病毒血凝素0．2ml。第11孔，紅細(xì)胞對照，鹽水0.4ml。

(6)溫室靜置10分鐘后，于l～11孔中各加入1％雞紅細(xì)胞0．2ml，搖勻。

病毒紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)可按下表進(jìn)行：

  (7)室溫靜置45分鐘后觀察結(jié)果：

  最高血清稀釋度能完全抑制紅細(xì)胞凝集者為紅細(xì)胞凝集抑制效價。比較早期、恢復(fù)期血清的血凝抑制抗體的效價，并作出判斷。

  注意事項(xiàng)：

  (1)發(fā)病早期、恢復(fù)期血清要同時做，以求條件一致。

  (2)其他事項(xiàng)與紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)類同。

病毒中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是較常用的病毒血清學(xué)試驗(yàn)方法。原理是特異性的抗病毒免疫血清（中和抗體)

和病毒結(jié)合后，使病毒失去毒力的作用。病毒中和試驗(yàn)通常須在動物、雞胚或組織培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行，常用于流行病學(xué)調(diào)查或病毒型別鑒定。

一、脊髓灰質(zhì)炎病毒分型鑒定

本實(shí)驗(yàn)用中和試驗(yàn)方法，在組織培養(yǎng)管中進(jìn)行脊髓灰質(zhì)炎病毒的型別鑒定。

(一)材料： 

I、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫血清(1：5)：

待鑒定病毒液；

人胚腎單層細(xì)胞培養(yǎng)管；

維持液(含2％小牛血清的Eagle液)。

(二)方法： ‘

以三型免疫血清(中和100TCID₅₀病毒的抗體滴度大于I/200)與新分離的病毒組織培養(yǎng)管進(jìn)行中和試驗(yàn)，以確定新分離病毒是否為脊髓灰質(zhì)炎病毒及其型別。

1、期待鑒定病毒稀釋成1：10，分別與三型特異性免疫血清(1：5稀釋)等量混合(0．12,ml+0．12m1)，在37℃水浴中作用12小時。 

2、接種于兩支組織培養(yǎng)管中，每管0．1ml，在37℃吸附半小時

3、各管加0．9ml維持液，置36℃孵育，觀察7天。

4、試驗(yàn)中應(yīng)包括血清對照、病毒對照和正常細(xì)胞對照，如下所示。

5、病毒加入免疫血清后，不出現(xiàn)病變者表示為該免疫血清所中和。

二、螢光局灶中和試驗(yàn)(FFN)

本試驗(yàn)以檢測輪狀病毒感染的病人雙份血清中特異性中和抗體，結(jié)合輪狀病毒電泳

及血清型別，以助該病毒的流行病學(xué)研究。

(一)材料：

MA104細(xì)胞；

輪狀病毒四個血清型毒株(Wa，s₂，YO，Hochi)；

牛輪狀病毒(NCDV)； 

豚鼠抗輪狀病毒血清；

陽性及陰性對照血清；

10％小牛血清的Eagle液；

羊抗豚鼠螢光抗體；

PBS，Tween—20；

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

(二)方法：

1、將MA104細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5—2.0×10⁴，37℃培養(yǎng)

24小時。接種病毒前用Eagle液洗二次。

2、用20μg/ml濃度的胰酶分別處理4個血清型的輪狀病毒毒株，置37℃30分鐘，用

Eagle液稀釋到200個螢光細(xì)胞／50μl。待檢血清經(jīng)56℃30分鐘滅活；用Eagle液從1：25

起，作二倍稀釋到1：1600。將50μl 各不相同稀釋度的血清混合后，至突37℃孵育1小時。  每一血清稀釋度加2孔(終濃度：病毒為100個螢光細(xì)胞／孔，血清為1：50至1：3200)，·

37℃孵育1小時后，每孔加100μl Eagle液，37℃培養(yǎng)20小時。

3、棄去培養(yǎng)液，加入200μl／孔-20℃無水乙醇，置4℃10分鐘固定細(xì)胞。棄去無水乙醇，吹干，用PSB—T液(含0.1％Tween—20的PBS)洗板一次。每孔加人100μl用PBS稀

釋成1：100的豚鼠抗輪狀病毒免疫血清，37℃孵育1.5小時。PBS—T液洗板3次，加入

100μl用PBS稀釋成1：100的羊抗豚鼠螢光抗體，37℃孵育1.5小時，用PBS—T液洗板3次，PBS液洗板1次，倒置96孔板在螢光顯微鏡下觀察結(jié)果。

(三)結(jié)果判斷

每塊細(xì)胞板均設(shè)有病毒對照、螢光檢測系統(tǒng)對照、陽性和陰性血清對照。從待檢血清

二孔平均螢光細(xì)胞數(shù)比病毒對照平均螢光細(xì)胞數(shù)減少50％的稀釋度倒數(shù)，作為中和抗體的滴度單位。

實(shí)驗(yàn)五  呼吸道感染的細(xì)菌

鏈球菌

鏈球菌也是常見的化膿性球菌之一。致病性鏈球菌可引起猩紅熱、丹毒產(chǎn)褥熱及變態(tài)反應(yīng)性疾病。本實(shí)驗(yàn)主要認(rèn)識鏈球菌的形態(tài)，、菌落特征及其分類。  

認(rèn)識鏈球菌溶血素“O”抗體的測定方法及其實(shí)用意義。 

(一)觀察甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、丙型鏈球菌的菌落形態(tài)及溶血情況。

(二)觀察乙型鏈球菌在血清肉湯中生長情況。

(三)觀察鏡下鏈球菌的革蘭氏染色形態(tài)。

(四)抗鏈球菌溶血素“O”的測定(膠乳法)。

原理：感染乙型溶血性鏈球菌后；病者血清中可有鏈球菌溶血毒素“O”的抗體(Anti—strep-

tolysin O．簡稱ASO)。人工制備的ASO膠乳試劑(即溶血毒素O的免疫微球)經(jīng)設(shè)法控制其分子數(shù)量較一般感染者所產(chǎn)生的ASO少，利用膠乳間接凝集抑制試驗(yàn)原理，使病者血清抗體在加入標(biāo)準(zhǔn)溶血毒素后O后，產(chǎn)生結(jié)合后多余的抗體，即可與ASO膠乳試冊發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)清晰均勻的凝集顆粒(ASO膠乳試劑是羧化聚苯乙烯膠乳與溶血毒素“O”的共價交聯(lián)產(chǎn)物)。

方法：

1、病人血清標(biāo)本用生理鹽水稀釋成1：50，以56℃水浴30分鐘，滅活補(bǔ)體。

2、于反應(yīng)板指定位置上，分別滴加已稀釋滅活的病人血清、陽性與陰性控制血情各一滴，再在各血清上各加標(biāo)準(zhǔn)溶血毒素O一滴，輕輕搖動約2分鐘使之混勻�！� ·

3、于上述三個液墑上各加ASO膠乳試劑一滴，輕搖8分鐘，觀察各位置上有無凝集顆粒以判定結(jié)果(見圖12—1)。  

 圖14  抗鏈球菌溶血素“O”的測定(膠乳法)示意圖

注意：

(1)1：50病人血清陽性反應(yīng)相當(dāng)于傳統(tǒng)Todd溶血試驗(yàn)ASO≥500單位。若反應(yīng)很顯著，應(yīng)將病人血清用生理鹽水稀釋為l：80，甚至1：100。

(2)1：80病人血清陽性反應(yīng)的ASO≥800單位，而1：100病人血清陽性的ASO≥1000單位。

肺炎球菌

肺炎球菌常寄居于正常人的鼻咽腔中，主要引起大葉性肺炎。本實(shí)驗(yàn)主要認(rèn)識肺炎球菌的生物學(xué)特性。

掌握肺炎球菌與甲型溶血性鏈球菌的鑒別。

(—)觀察肺炎球菌在血平板上的菌落形態(tài)及溶血特性。

(二)觀察鏡下肺炎球菌的革蘭氏染色形態(tài)和莢膜染色形態(tài)。

(三)肺炎球菌與甲型溶血性鏈球菌的鑒別。

肺炎球菌菌落與甲型溶血性鏈球菌菌落難于區(qū)分，須借助于膽汁溶菌試驗(yàn)與菊糖發(fā)酵試驗(yàn)方能鑒別。故需做下面幾個試驗(yàn)：

1、膽汁溶菌試驗(yàn)：  

分別取在37℃培養(yǎng)18小時的肺炎球菌及甲型溶血性鏈球菌肉湯培養(yǎng)物各0.8毫升，置于小試管內(nèi)，再加入無菌膽汁0.2毫升(或10％去氧膽酸鈉溶液0.1毫升)。同時以生理鹽水0.2毫升與菌液0.8毫升放入另—試管作為對照。搖勻后，置37℃水浴箱中10—15分鐘，觀察結(jié)果。肺炎球菌因其自溶酶被膽汁激活，使菌溶解而變?yōu)槌吻澹�甲型溶血性鏈球菌不被溶解，對照管液體應(yīng)混濁。

2、菊糖發(fā)酵試驗(yàn)

接種菊糖血清肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)37℃18—24小時后，肺炎球菌能發(fā)酵菊糖產(chǎn)酸，而甲型溶血性鏈球菌則否。

3、乙基氫化羥基奎寧(Optochin)敏感試驗(yàn)：

幾乎所有肺炎球菌的菌株都對乙基氫化羥基奎寧(C₂H₅O.C₃H₄N.CHOH.C₇H₁N.C₂H₅,  Optochin)敏感，而鏈球菌通常不被其抑制。將細(xì)菌劃線接種于含血瓊脂平板上，鑷取無菌小圓濾紙(直徑6毫米)浸于1：4000無菌Optochin水溶液中，放血平板上，37℃孵育18—24小時后取出觀察結(jié)果。肺炎球菌可于紙片周圍呈現(xiàn)直徑大于20毫米的抑菌圈，而鏈球菌無抑菌圈，或偶呈現(xiàn)直徑小于15毫米的抑菌圈。

分枝桿菌

分枝桿菌是一類細(xì)長桿菌，因繁殖時有分枝生長趨勢而得名。本屬細(xì)菌一般不易著色，若經(jīng)加溫或延長染色時間而著色后，即能對抗鹽酸酒精的脫色作用，故又稱抗酸性桿菌。致病者主要有結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌。

本實(shí)驗(yàn)主要掌握抗酸性染色法。

認(rèn)識結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)、培養(yǎng)、動物試驗(yàn)方法。

觀察麻風(fēng)分枝桿菌的形態(tài)特點(diǎn)。

   一、結(jié)核分枝桿菌形態(tài)觀察： 

觀察鏡下結(jié)核病人痰標(biāo)本涂片，結(jié)核分枝桿菌抗酸染色的形態(tài)特點(diǎn)。

  &nbs醫(yī)學(xué)考研網(wǎng)p;二、結(jié)核病人痰液抗酸染色檢查法：

材料：

結(jié)核病人痰液；

染色液：石炭酸復(fù)紅，3％鹽酸酒精、呂氏美藍(lán)(見附錄)；

玻片。

方法：

(—)涂片的制備，取患者清晨咳出的痰液，用棉拭子小心沾取痰液少許涂片。涂片自然干燥后，通過火焰固定，然后進(jìn)行染色。

(二)染色方法：

1、將涂片平放于染色架上方的支架上(注意平放以免染色液傾瀉)，滴加石炭酸復(fù)紅液(須加稍多量)。  

2、用酒精燈在玻片下加溫，至微有蒸氣冒出時，移去酒精燈，到蒸汽減少時，再加溫，如此持續(xù)5分鐘(但注意不可將染液煮沸或煮干)，用水清洗。

3、以3％鹽酸酒精充分脫色，隨即用水沖洗。

4、再用呂氏美藍(lán)染1分鐘，用水沖洗，待干，在油鏡下檢查。

結(jié)果：

抗酸菌染成紅色，非抗酸菌染成藍(lán)色。

(結(jié)核病人痰抗酸染色厚片見附錄)。

三、觀察結(jié)核分枝桿菌菌落：

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)于羅(Lowenstein)氏培養(yǎng)基(見附錄)上的菌落呈干燥顆粒狀；乳白色或米黃色，形似椰菜花樣，注意接種日期。

    四、結(jié)核抗體IgG的檢測：參閱《免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》實(shí)驗(yàn)八：免疫標(biāo)記技術(shù)。 

五、麻風(fēng)分枝桿菌形態(tài)觀察：  

直接涂片是麻風(fēng)分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢查方法之一，自患處刮取標(biāo)本或自患者鼻部取標(biāo)本，涂片，作抗酸性染色。

觀察鏡下麻風(fēng)分枝桿菌的抗酸性染色形態(tài)特征，注意其排列的情況。

實(shí)驗(yàn)六、七 腸 道 桿 菌

腸道桿菌是一類革蘭氏陰性桿菌，其中一些為非致病菌(包括大腸埃希氏菌、變形桿

菌、產(chǎn)氣桿菌等)，另一些為致病菌，主要有沙門氏桿菌(如傷寒沙門氏菌與副傷寒沙門氏

菌)與痢疾志賀氏菌。它們的形態(tài)相似，但生化反應(yīng)及抗原結(jié)構(gòu)頗有差異。因此，常用生化

反應(yīng)與血清學(xué)試驗(yàn)作分類鑒別。

材料：

大腸桿菌、主要沙門氏菌及痢疾志賀氏菌的形態(tài)、菌落及生化反應(yīng)標(biāo)本，糞便檢材。

內(nèi)容與方法：

 一、大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌

   了解腸道桿菌均為革蘭氏陰性桿菌，形態(tài)無特殊。  

了解腸道桿菌的生化反應(yīng)與血清學(xué)試驗(yàn)及其在鑒定上的意義。

(一)菌落觀察：

觀察S．S．瓊脂平板培養(yǎng)基(見實(shí)驗(yàn)七附錄)上的大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、痢疾

志賀氏菌的菌落特征。

(二)形態(tài)觀察(參考)：  

觀察鏡下大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌的革蘭氏染色形態(tài)，注意形態(tài)

染色性有無區(qū)別。  

(三)生化反應(yīng)觀察：

觀察大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌和痢疾志賀氏菌在雙糖鐵培養(yǎng)基(見附錄)的生化反應(yīng)，觀察變形桿菌的尿素分解反應(yīng)。

（四)血清學(xué)鑒定(方法見糞便標(biāo)本檢查項(xiàng))。

二、腸道桿菌致病菌的分離鑒定(糞便標(biāo)本的檢查)：

糞便中存在的細(xì)菌很多，常見的病原菌有沙門氏菌屬、志賀氏菌屬的細(xì)菌、致病性大

腸埃希氏菌、霍亂弧菌和結(jié)核分枝桿菌等。除檢查霍亂弧菌外，一般不做直接涂片檢查。同時檢材必須注明檢查目的，以便選擇檢查方法。下面以自糞便標(biāo)本分離沙門氏菌屬和志賀氏菌屬的細(xì)菌為例。

這些腸道細(xì)菌都是革蘭氏陰性桿菌，它們之間的鑒別，主要依靠生化反應(yīng)檢查和血清

學(xué)鑒定的方法。通常取糞便作致病性腸道桿菌鑒定的步驟是：選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌→生化反應(yīng)鑒定→血清學(xué)抗原鑒定。

(一)標(biāo)本采集：

用無菌棉拭子取患者糞便少許(疑為痢疾病人時，應(yīng)挑以粘液膿血部分)，標(biāo)本應(yīng)盡快

分離培養(yǎng)，如不能立即接種，應(yīng)放冰箱或存放于緩沖甘油鹽水保存液中。

（二)檢查程序：

(三)沙門氏菌屬的鑒定與分型：

1、生化反應(yīng)：  

沙門氏菌屬中，除傷寒沙門氏菌在發(fā)酵中不產(chǎn)氣外，通常在分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇及山梨醇中均產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不分解乳糖、蔗糖及水楊素；不產(chǎn)生靛基質(zhì)、不液化明膠；硫化氫反應(yīng)通常為陽性。

2、血清學(xué)分型鑒定：

（1)取純菌培養(yǎng)物，先與A—E群沙門氏菌多價⊕血清做玻片凝集試驗(yàn)，陽性者認(rèn)為該菌屬于沙門氏菌屬。

（2)用沙門氏菌屬各群特有的單價⊕因子血清，做玻片凝集反應(yīng)，可最后判定為何種菌。

（4)新分離的傷寒沙門氏菌，丙型副傷寒沙門氏菌株，常只與Vi血清凝集，而不和⊕血清凝集。如將培養(yǎng)物加熱100℃30分鐘（破壞Vi抗原)即可與多價⊕血清和⊕因子血清凝集。  

(5)與A-E群多價⊕血清凝集，而與各個⊕因子血清卻不凝集的菌株，有時可能屬于副大腸桿菌(如亞利桑那或枸椽酸鹽菌)。這部分菌株與沙門氏菌有密切聯(lián)系，不僅某些生化反應(yīng)極為相似，而且?guī)в信c沙門氏菌相同的O與H抗原。

(四)志賀氏菌的鑒定與分型：

1、生化反應(yīng)： ． ·

痢疾志賀氏菌均能發(fā)酵葡萄糖；A群不發(fā)酵甘露醇，B、C、D群大部分發(fā)酵；宋內(nèi)氏能遲緩發(fā)酵乳糖，其余均不能使乳糖發(fā)酵；除少新城型、孟城型在發(fā)酵糖類時產(chǎn)生微量氣體

外，其余不產(chǎn)氣；不發(fā)酵水楊素和側(cè)金盞醇；于枸椽酸鹽培養(yǎng)基上不生長；V-P(Voges—Pmskauer)試驗(yàn)陰性；不分解尿素和液化明膠；不產(chǎn)生硫化氫。

  主要沙門氏菌抗原結(jié)構(gòu)表

志賀氏菌屬生化反應(yīng)表

  2、血清學(xué)分型鑒定：

  志賀氏菌一般只含O抗原，根據(jù)O抗原不同，可分為四個群，有的群還可以分為若干血清型及亞群。

A群：包括10個血清型，均為甘露醇發(fā)酵陰性，其中1型即志賀氏痢疾桿菌，2型即史密斯氏志賀菌。其余各型十分罕見。

B群：即福氏志賀菌，包括甘露酵發(fā)酵陰性，已有13個血清型(包括亞型和變種)。

C群：即鮑氏志賀菌，此群共15個菌型(一般能分解甘露醇)。

D群：即宋內(nèi)氏志賀菌，只有一個血清型，分解甘露醇，但其菌落�？沙霈F(xiàn)兩種不同形 態(tài)變種：S型和R型。

經(jīng)初步檢查符合志賀氏菌屬生化特征的菌株，均需用診斷血清及因子血清分型。在進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)時可參照生化反應(yīng)，具體做法如下：

①甘露醇不發(fā)酵，靛基質(zhì)陰性者，用志賀氏1型(原志賀氏)診斷血清；

②甘露醇不發(fā)酵，靛基質(zhì)陰性者，用志賀氏2型診斷血清；

③甘露醇發(fā)酵、乳糖不發(fā)酵者，用福氏及宋內(nèi)氏診斷血清；

④甘露醇發(fā)酵，乳糖遲發(fā)酵者，用宋內(nèi)氏診斷血清；

⑤甘露醇發(fā)酵，福氏及宋內(nèi)氏血清不凝集者，再用鮑氏診斷血清。

⑥仍不凝集者，應(yīng)考慮K抗原存在，要將菌材料傳代或煮沸，再用福氏、宋內(nèi)氏及鮑

氏血清做凝集反應(yīng)。福氏診斷血清最后鑒定菌型要用因子(單型)血清。

三、肥達(dá)氏試驗(yàn)(Widal test)    

人患傷寒后。經(jīng)過一定的時間，血清內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體，此種抗體與傷寒沙門氏菌結(jié)合時，能使細(xì)菌發(fā)生凝集，肥達(dá)氏試驗(yàn)即利用此原理來作為傷寒病或副傷寒病的輔助診斷。

材料：可疑傷寒病人血清(稀釋成1：10)； ．：

傷寒沙門氏菌“O”抗原、傷寒沙門氏菌“H’’抗原； ：

甲型副傷寒沙門氏菌“H”抗原(A)、乙型副傷寒沙門氏菌“H”抗原(B)

生理鹽水、小試管、1毫升吸管。 

方法：  

(一)取潔凈小試管28支，排列在試管架上，分為4排，每排7支，依次用蠟筆注明管

號，用吸管吸取生理鹽水分裝于小試管中，每支0．5毫升。

(二)用1毫升吸管吸取1：10的病人血清0．5毫升，加入第l排第1管內(nèi)，于管內(nèi)連續(xù)

吹吸3次，使血清與鹽水充分混合，然后吸出0.5毫升放人第2管，同樣吹吸混勻后，吸出

0．5毫升放人第3管，如此繼續(xù)稀釋到第6管，自第6管吸出0．5毫升棄去。此時第1管

到第6管的血清稀釋倍數(shù)為1：20-1：640。第7管不加血清作為對照。

(三)同法于2、3、4排試管中將人血清依次稀釋。

(四)血清稀釋完畢后，于第1排加入傷寒沙門氏菌“H”抗原，每管0．5毫升；第2排加入傷寒沙門氏菌“O”抗原；第3排加入甲型副傷寒沙門氏菌“H”抗原(A)；第4排加入乙型副傷寒沙門氏菌“H”抗原(B)，每管均為0.5毫升。

    (五)輕輕振蕩試管架,使各管內(nèi)容物混勻，放37℃溫箱中過夜，次日取出觀察結(jié)果。凡與抗原能產(chǎn)生‘‘++”凝集的最高血清稀釋度，即為該血清的凝集效價。

(六)觀察結(jié)果注意點(diǎn)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中的試管凝集反應(yīng)同 

實(shí)驗(yàn)八  創(chuàng)傷感染的細(xì)菌

 葡萄球菌

葡萄球菌是化膿性炎癥最常見的病原菌，分布廣泛，主要引起疾病者為金黃色葡萄球。

本實(shí)驗(yàn)主要認(rèn)識葡萄球菌的生物學(xué)特性，掌握致病性與非致病性葡萄球菌鑒別法。

(一)觀察金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌在血平板上的菌落形態(tài)，溶血特性及色素。

(二)白斜面菌種取菌涂片作葡萄球菌的革蘭氏染色形態(tài)觀察(因從固體培養(yǎng)基取材涂片，應(yīng)用生理鹽水稀釋)。  

(三)病原性葡萄球菌的鑒定：

1、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：觀察金黃色和表皮葡萄球菌對甘露醇發(fā)酵情況。

2、血漿凝固酶試驗(yàn)(Coagulase Test)：  

(1)試管法——于各含0.3ml兔血漿的二支小試管中，分別加入金黃色和表皮葡萄球菌各二接種環(huán)，混勻后放37℃水浴箱中1小時，取出觀察結(jié)果(游離型血漿凝固酶)。

(2)玻片法——取載玻片一張，用毛細(xì)吸管吸兔(或人)血漿，按圖示（見圖11-1)滴于玻片上，再以接種環(huán)無菌法取葡萄球菌分別放人圖示液滴中并混勻。于數(shù)分鐘內(nèi)觀察是否出現(xiàn)凝固小顆粒以判定結(jié)果(結(jié)合型血漿凝固酶)；實(shí)驗(yàn)中應(yīng)以生理鹽水做一份對照。

圖11—1 血漿凝固酶試驗(yàn)(玻片法)

厭氧芽胞桿菌

厭氧芽胞桿菌又稱梭狀芽胞桿菌，均為G⁺桿菌。對人致病者有破傷風(fēng)桿菌、氣性壞疽病原菌和肉毒桿菌。

了解常用的厭氧培養(yǎng)法。

認(rèn)識破傷風(fēng)桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌及肉毒桿菌的形態(tài)及培養(yǎng)特點(diǎn)。，

觀察破傷風(fēng)桿菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌的動物試驗(yàn)，以理解兩菌的致病特點(diǎn)。

 一、厭氧培養(yǎng)法

(—)庖肉(肉渣)培養(yǎng)法：

1、將破傷風(fēng)桿菌(或產(chǎn)氣莢膜桿菌)菌液分別接種子一管庖肉培養(yǎng)基(Cooked MeatMedum)及一管普通肉湯培養(yǎng)基中。

2、放37℃培養(yǎng)48—72小時后觀察有無生長，并作涂片染色檢查。

注：庖肉培養(yǎng)基肉渣中不飽和脂肪酸的氧化，能消耗溶解于培養(yǎng)液中的氧，且組織中所含的還原性化合物，如谷胱甘肽(含—SH基)，可使培養(yǎng)基的氧化還原電勢下降，故造成厭氧環(huán)境。

(二)焦性沒食子酸法：

材料：

產(chǎn)氣莢膜桿菌菌液；

血平扳、無菌玻璃板(12* 12cm)、消毒小方紗布，焦性沒食子酸、20％NaOH、毛細(xì)吸管、溶化石蠟。

方法：

1、取產(chǎn)氣莢膜桿菌菌液；劃線接種于—血平板上；然后取無菌玻璃板，中央放一小塊紗布，紗布上放0.5克焦性投食子酸；用吸管加入lml20％NaOH，立即將已接種的平板復(fù)蓋于其上，并迅速用已溶化的石蠟封好平板與玻璃之間的空隙，待封固后置37℃溫箱中孵育48小時看結(jié)果(見圖21—1)。

圖15  平板焦性沒食子酸厭氧培養(yǎng)法

2、取上述菌液接種于另一平板上，在普通有氧環(huán)境下，置37℃孵育48小時，觀察有無細(xì)菌生長。

(三)厭氧袋法：

1、將接種好的血平板以及產(chǎn)氣管、指示劑、催化劑一并放人塑料袋內(nèi)，并用大鐵夾將塑料袋夾緊密封，以防漏氣(如圖21—2)。  

2、將產(chǎn)氣管內(nèi)的安瓿自尖端弄破，隨后即有C0₂和H₂產(chǎn)生(大多數(shù)厭氧菌的生長還需要有一定量的C0₂)。

反應(yīng)式如下：

C₃H₃O₇+NaHCO₃→Na（C₆H₅O₇)+3H₂O+3CO₂

NaBH₄+2H₂0→NaB0₂+4H₂

催化劑(鈀)可催化H₂和袋內(nèi)的O₂生成H₂O，從而耗盡袋內(nèi)的O₂，由此造成厭氧環(huán)境。

3、產(chǎn)氣管弄破半小時后將指示劑(美白)安瓿弄破，如美白(無色)不變成美藍(lán)(藍(lán)色)，則指示袋內(nèi)已成厭氧環(huán)境(厭氧環(huán)境的另一指標(biāo)是袋內(nèi)產(chǎn)生多量的小水珠)。

4、將上述厭氧袋置37℃溫箱孵育48小時觀察結(jié)果。

附注：造成厭氧環(huán)境取決于三個因素：①塑料袋密封；②產(chǎn)生足量的H₂；③鈀的活性正常。

圖16  厭氧培養(yǎng)—厭氧袋法

二、觀察鏡下破傷風(fēng)桿菌、肉毒桿菌的革蘭氏染色形態(tài)及產(chǎn)氣莢膜桿菌的莢膜染色形態(tài)。

三、觀察破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌在庖肉培養(yǎng)基中的生長特點(diǎn)和在血平板的菌落特點(diǎn)。

四、觀察產(chǎn)氣莢膜桿菌在牛乳培養(yǎng)基(Milk Medium)中的生長現(xiàn)象：

產(chǎn)氣莢膜桿菌，強(qiáng)烈發(fā)酵牛奶，使牛乳凝固，析出乳清，凝固的牛乳又被氣體穿破呈海棉狀，甚至將覆蓋層之凡士林推至管口，稱之為洶涌發(fā)酵。

五、觀察產(chǎn)氣莢膜桿菌在高層葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象：

六、破傷風(fēng)毒素抗毒素中和試驗(yàn)：

(—)材料：

破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)物濾液、破傷風(fēng)抗毒素、小白鼠及無菌注射器等。

(二)方法：  

1、將破傷風(fēng)抗毒素0.2毫升(內(nèi)含抗毒素100—200單位)注射于小白鼠腹腔，經(jīng)過一小時后，再于小白鼠后腿肌肉注入經(jīng)適當(dāng)稀釋的破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)物濾液(內(nèi)含外毒素)0.1毫升。

2、取另一只未注射抗毒素的小白鼠，將同量的破傷風(fēng)桿菌培養(yǎng)物濾液注射于后腿肌肉內(nèi)。  

以上兩只小白鼠分別用染料作標(biāo)記。

3、第二天觀察結(jié)果，未經(jīng)注射抗毒素的小白鼠，可見注射外毒素—側(cè)的下肢和尾巴首先強(qiáng)直，并逐漸延及另側(cè)下肢及全身；1—2日后死亡；而預(yù)先注射抗毒素的小白鼠則不發(fā)病，受到保護(hù)。

七、產(chǎn)氣莢膜桿菌的動物試驗(yàn)：

取0.5毫升產(chǎn)氣莢膜桿菌培養(yǎng)物，自尾靜脈注射于小白鼠，10分鐘后將其殺死。放37℃溫箱中5—8小時，取出可見小鼠尸體氣腫現(xiàn)象，尸體剖檢可見肌肉有壞死，肝臟呈泥狀，并有特殊的臭味。取其肝臟作涂片，染色鏡檢，可見具有莢膜的產(chǎn)氣莢膜桿菌。

實(shí)驗(yàn)九  性感染和輸血感染的微生物

梅毒螺旋體

   梅毒螺旋體尚不能用人工方法培養(yǎng)分離，臨床以直接涂片鏡檢和血清學(xué)試驗(yàn)為主要檢測手段。在梅毒血清學(xué)試驗(yàn)中，常用的方法：有華氏(Wassermann)反應(yīng)，康氏(Kahn)反應(yīng)等一類非密螺旋體抗原試驗(yàn)，是用正常牛心肌類脂質(zhì)抗原測定病人血清中的反應(yīng)素；也有梅毒螺旋體制動試驗(yàn)，間接血凝試驗(yàn)和熒光抗體試驗(yàn)第一類密螺旋體抗原試驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)介紹一種改良的梅毒血清學(xué)試驗(yàn)-USR。該試驗(yàn)即可定性，又可定量。試劑及對照已標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡單，有較高的敏感性。但同屬于非特異性反應(yīng)素試驗(yàn)，故應(yīng)結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。

(—)材料：

USR試劑(主要包括以純化的心磷脂、卵磷脂、膽固醇配制的VDRL抗原)；

反應(yīng)板；

滴管、專用針頭(45滴／毫升±1滴)；

反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)圖(見圖17)；

梅毒陽性血清對照。

(二)方法：

玻片定性試驗(yàn)(在23~29℃下進(jìn)行)

1、  吸取待檢血清(不需56℃滅活)0.05毫升加入并擴(kuò)散在玻片圓圈中。

2、用專用針頭滴管，吸取本試劑，于上述血清中垂直滴注抗原1滴。

3、按每分鐘約180次用手式機(jī)械搖動玻片4分鐘，在3分鐘內(nèi)置于100倍顯微鏡下觀察結(jié)果。

4、結(jié)果判斷(按USR試驗(yàn)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn))：

陽性反應(yīng)(3+—4+)：可見中等至大的凝塊，溶液清亮。

弱陽性反應(yīng)(1+—2+)：可見小的顆粒聚集物。

可疑反應(yīng)(±)：可見細(xì)小粗糙物，分布不規(guī)則。

．  陰性反應(yīng)(—)：抗原顆粒均勻分布，無塊狀物。