森林腦炎疫苗系用森林腦炎病毒“森林”株接種于地鼠腎單層細(xì)胞，培育后收獲病毒液，加52667788.cn/sanji/入甲醛溶液將病毒滅活后制成。用于預(yù)防森林腦炎。
1 毒種
1.1 毒種來源
衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所保存之凍干毒種“森林”株。每3～5年會(huì)同中國(guó)藥品生物制品檢定所應(yīng)用新分離的流行株病毒攻擊，檢測(cè)“森林”株的保護(hù)力，以了解該毒株的有效性。
1.2 毒種檢定
1.2.1 無菌試驗(yàn)
毒種啟封及每次傳代后，均需做無菌試驗(yàn)，合格者方可使用。
1.2.2 病毒滴定
每正代必須用小白鼠進(jìn)行腦內(nèi)滴定。滴度≥9.0LogLD50/1.0ml方可用于生產(chǎn)。
1.2.3 純毒試驗(yàn)
生產(chǎn)前須用小白鼠腦內(nèi)法做中和試驗(yàn)鑒定毒種的特異性，中和指數(shù)必須在500以上。生產(chǎn)中如對(duì)毒種有懷疑，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行鑒定。
1.3 毒種傳代
分正亞代傳遞。傳遞代數(shù)正代不得超過15代，傳代時(shí)選用體重10～12g健康小白鼠或乳鼠。每次毒種傳代不得少于3個(gè)鼠腦。腦內(nèi)接種病毒，72小時(shí)后選擇眼結(jié)膜正常，有典型戰(zhàn)栗、痙攣、肢體麻痹的小白鼠，處死后無菌取腦，并進(jìn)行無菌試驗(yàn)。如發(fā)現(xiàn)污染者，應(yīng)及時(shí)廢棄。
1.4 毒種保存
鼠腦毒種收剖經(jīng)無菌試驗(yàn)后立即保存于-60℃以下，無菌試驗(yàn)通過后方可使用。亦可將鼠腦毒種研磨乳化制成10%腦懸液，分裝小瓶，凍存于-60℃以下，無菌試驗(yàn)合格后備用。
凍干毒種保存在2～8℃。
森林腦炎病毒“森林”株屬二類毒種，必須設(shè)專人按有關(guān)規(guī)定負(fù)責(zé)管理，使用前、后記錄清楚。
2 疫苗制造
2.1 細(xì)胞制備
2.1.1 地鼠
選用2周齡左右的健康地鼠。如發(fā)現(xiàn)腎臟異�；蛴腥槊訝�腹水，應(yīng)廢棄。
2.1.2 細(xì)胞消化及培養(yǎng)
處死地鼠，無菌取腎，加入適量胰蛋白酶液消化。用營(yíng)養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)液中牛血清含量不得超過8%。
2.1.3 外源因子檢查
每生產(chǎn)批細(xì)胞留5%（或不少于500ml)懸液作為對(duì)照細(xì)胞檢查外源病毒。該細(xì)胞除不接種病毒外，細(xì)胞嘗試和處理均與生產(chǎn)過程平行進(jìn)行。至原液收獲之日，用顯微鏡觀察，應(yīng)無病變發(fā)生。并用0.2%～0.5%豚鼠紅細(xì)胞（4℃保存不超過7天)進(jìn)行血吸附試驗(yàn)，置4～8℃30分鐘判定結(jié)果；再置20～25℃30分鐘再次判定結(jié)果，均應(yīng)為陰性。如有可凝病變或血吸附可疑陽性，在同種細(xì)胞上繼續(xù)盲傳，如傳出病毒，該批細(xì)胞制備的疫苗應(yīng)予廢棄。
2.2 病毒接種和培育
2.2.1 生產(chǎn)毒種配制
將鼠腦毒種解凍乳化，制成10%～20%腦懸液，離心，取上清液作為毒種。亦可用冰凍鼠腦毒種懸液感染細(xì)胞。
2.2.2 病毒接種和培育
選擇生長(zhǎng)良好的細(xì)胞瓶，充分噴洗細(xì)胞后，加入適量含有病毒的營(yíng)養(yǎng)液（病毒量不得大于7.0LogLD50/1.0ml)，在適當(dāng)溫度下培育適當(dāng)時(shí)間，棄去病毒培養(yǎng)液，換以新維持液，繼續(xù)培育一定時(shí)間。
2.2.3 疫苗生產(chǎn)過程中不得加青霉素或其他β內(nèi)酰胺類抗生素。
2.3 原液
2.3.1 病毒滅活
選擇有典型細(xì)胞病變的培養(yǎng)瓶，經(jīng)肉眼檢查無菌者進(jìn)行澄清過濾，按瓶取無菌試驗(yàn)及病毒滴定樣品，取樣后立即加甲醛溶液和硫柳汞，使甲醛的最終濃度為0.05%，硫柳汞為0.005%，置適當(dāng)溫度下滅活。
無菌試驗(yàn)為接種瓊脂斜面培養(yǎng)基，3天判定，長(zhǎng)菌者廢棄。
2.3.2 過濾合并及取樣
單瓶無菌試驗(yàn)未長(zhǎng)菌、滅活到期、病毒滴定合格的疫苗進(jìn)行過濾合并，搖勻后做無菌試驗(yàn)，取安全試驗(yàn)和效力試驗(yàn)樣品。
安全試驗(yàn)每批合并檢定疫苗量不得超過15萬ml，效力試驗(yàn)每批合并檢定疫苗量不得超過100萬ml。檢定批號(hào)和成品批號(hào)應(yīng)一致。
2.3.3 原液檢定
2.3.3.1 無菌試驗(yàn)
按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
2.3.3.2 病毒滴定
將滴定樣品做10倍系列稀釋，取至少3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度病毒液腦內(nèi)接種體重7～9g小白鼠4只，每只0.03ml，逐日觀察，14天判定結(jié)果（3天內(nèi)非特異性死亡者不計(jì)，)滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判為合格。不合格者可重試一次。
每個(gè)滴定批代表疫苗量不得超過15萬ml。
2.4 半成品檢定
2.4.1 滅活試驗(yàn)
（1)動(dòng)物法：將樣品腦內(nèi)接種體重12～14g小白鼠8只，每只0.03ml，同時(shí)腹腔接種0.5ml，為第一代；7天后將第一代小白鼠處死3只，取腦做成10%懸液，腦內(nèi)接種6只小白鼠，為第二代；7天后將第二代小白鼠處死3只，同法接種6只小白鼠，為第三代。每代小白鼠從接種之日起逐日觀察14天，在觀察過程中全部健存為合格，接種后3日內(nèi)非特異性死亡者不計(jì)。
若傳代3日后有個(gè)別小白鼠死亡，應(yīng)立即取死鼠腦乳化成懸液再接種3只小白鼠，觀察14天，該3只小白鼠健存仍判為合格。如仍有小白鼠死亡，該批疫苗應(yīng)重試，重試合格后仍可使用。若傳出活病毒應(yīng)重試，查明原因。必要時(shí)繼續(xù)滅活并進(jìn)行滅活試驗(yàn)，若仍傳出活病毒，該批半成品應(yīng)予廢棄。
（2)細(xì)胞培養(yǎng)-動(dòng)物法：將樣品50ml裝入透析袋內(nèi)，放入6000～8000ml維持液中于4℃透析24小時(shí)，接種地鼠腎細(xì)胞或BHK21細(xì)胞，每ml樣品接種不少于3cm2的細(xì)胞片，置培養(yǎng)病毒的溫度下培育14天，全部健存判為合格。若有死亡者應(yīng)查明原因或重試，重試合格者仍可使用，不合格者應(yīng)廢棄。
以上兩種滅活試驗(yàn)方法可任選一種。
2.4.2 殘余牛血清蛋白含量測(cè)定
用檢定所認(rèn)可的試劑和方法測(cè)定，殘余牛血清蛋白含量應(yīng)≤50ng/ml。
2.4.3 效力試驗(yàn)
每批疫苗腹腔免疫體重10～12g小白鼠35只，于第1、3、5日共免疫3次，每次每只小白鼠0.3ml。另取同批小白鼠35只作為空白對(duì)照。于第10日以“森林”毒種0.3ml進(jìn)行腹腔攻擊，每天觀察1次，觀察21天判定結(jié)果。對(duì)照組LogLD50/0.3ml在7.5以上，免疫保護(hù)指數(shù)達(dá)100000以上為合格。不合格者可重試1次。
3 成品檢定
3.1物理檢查
疫苗應(yīng)為橘紅色透明液體，無異物。
3.2 化學(xué)檢查
按《生物制品化學(xué)檢定規(guī)程》進(jìn)行。pH值為7.2～8.0。游離甲醛不高于0.05%，硫柳汞不高于0.01%。
3.3 無菌試驗(yàn)
按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.4 安全試驗(yàn)
每批疫苗腹腔注射體重18～20g小白鼠4只，每只0.5ml，逐日觀察，3日內(nèi)全部健存判為合格。如有小白鼠死亡，除檢查原因外，應(yīng)立即進(jìn)行重試。
3.5亞硫酸氫鈉檢定
分裝后亞硫酸氫鈉要進(jìn)行含量測(cè)定和無毒性試驗(yàn)。含量不得低于原配濃度的60%。無毒性試驗(yàn)系將樣品稀釋成1∶100，腹腔注射體重18～20g小白鼠2只，每只0.5ml，觀察5日，應(yīng)全部健存。
4 保存與效期
保存于2～8℃暗www.med126.com處。自效力檢定合格之日起效期為2年。
