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關(guān)鍵詞： 消化系統(tǒng)腫瘤/治療；自殺基因；基因療法
Subject headings digestive system neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy
在惡性腫瘤的各種基因治療中，自殺基因(suicide gene)/前藥(prodrug)系統(tǒng)備受關(guān)注. 目前已在多種腫瘤進(jìn)行大量臨床前研究，有的已進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn). 該療法對(duì)消化系腫瘤的治療作用，業(yè)已得到證明［1］. 不管哪一種自殺基因/前藥系統(tǒng)，均需有下列3個(gè)成分：①能編碼一種酶的自殺基因：該基因通常來(lái)源于病毒或真核細(xì)胞，其編碼的酶能將無(wú)毒的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚远疚铮鸢屑?xì)胞死亡；在缺乏前藥的條件下，該種基因的表達(dá)對(duì)機(jī)體無(wú)害；該基因編碼的酶對(duì)基質(zhì)(前藥)應(yīng)具有高度催化效能(高Kcat)［2］. ②基因轉(zhuǎn)移載體(gene-transfer Vectors)：為了轉(zhuǎn)移自殺基因至靶細(xì)胞，一般采用基因工程改造的逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相關(guān)性病毒(adenovirus-associated viruses)作為載體［3］. 也有人采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為載體，發(fā)現(xiàn)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有高度親和力［4］. 基因轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵是其靶向性(targeting)［5］. 如將甲胎蛋白(AFP)啟動(dòng)子和清蛋白增強(qiáng)子(Alb)TRS連接自殺基因，則后者便僅于表達(dá)AFP的肝癌細(xì)胞中表達(dá)，而不影響正常肝細(xì)胞［6］. ③能被自殺基因編碼的酶作用的前藥(prodrug)：這種前藥在自殺基因不存在時(shí)，對(duì)機(jī)體無(wú)毒或僅有微小毒性，而在自殺基因編碼的酶特異性作用下，前藥轉(zhuǎn)化為活性藥物，后者的細(xì)胞毒性較無(wú)活性的前藥至少?gòu)?qiáng)100倍.
1 自殺基因/前藥系統(tǒng)
1.1 單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(HSV-tk/GCV)系統(tǒng) 表達(dá)單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-1 thymidine kinase, HSV-tk)的小鼠成纖維細(xì)胞，對(duì)戊環(huán)鳥苷(ganciclovir, GCV)的敏感性較野生型細(xì)胞強(qiáng)1000倍，在BALB/c小鼠，給予GCV，可使表達(dá)HSV-tk的肉瘤和Abelson白血病病毒性淋巴瘤完全退縮. 上述發(fā)現(xiàn)奠定了HSV-tk/GCV系統(tǒng)的基礎(chǔ). GCV本身無(wú)毒性，在HSV-tk作用下，變成GCV單磷酸鹽(GCV-MP)，再經(jīng)內(nèi)源性細(xì)胞激酶作用，迅速轉(zhuǎn)化為其二磷酸-(GCV-DP)和三磷酸鹽(GCV-TP)，后者對(duì)增殖中的哺乳細(xì)胞具有高度毒性. 雖然哺乳動(dòng)物細(xì)胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的轉(zhuǎn)化，但HSV-tk的作用比其強(qiáng)200倍. GCV-TP具有羥基，能插入DNA鏈中，引起堿基配對(duì)錯(cuò)誤、DNA斷裂、姐姝染色單體交換和致死性基因失穩(wěn)定［7］；GCV-TP尚能抑制DNA聚合酶，進(jìn)一步阻止DNA合成［8］. 在暴露于GCV后，表達(dá)HSV-tk的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)迅速聚集GCV磷酸鹽，而未表達(dá)HSV-tk的野生型細(xì)胞則無(wú)GCV磷酸鹽測(cè)得；將HSV-tk轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與3H標(biāo)記的GCV一起孵育，發(fā)現(xiàn)放射性標(biāo)記物迅速而穩(wěn)定地?fù)饺爰?xì)胞DNA內(nèi). 應(yīng)用IH核磁共振分光鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織在HSV-tk/GCV治療后，含膽堿物質(zhì)的顯性彌散系數(shù)減少50%，而迅速?gòu)浬⑿运煞值娘@性彌散系數(shù)增加219%，細(xì)胞內(nèi)粘滯度明顯增加，而大分子物質(zhì)的流體動(dòng)力學(xué)面積可能減少［9］；動(dòng)力學(xué)分析顯示細(xì)胞內(nèi)P53蛋白水平先增加，繼之cyclin β1蛋白水平升高，細(xì)胞周期中止于S/G2［10］. 上述事實(shí)說(shuō)明HSV tk/GCV引起腫瘤細(xì)胞凋亡. HSV-tk/GCV系統(tǒng)不僅能殺滅表達(dá)HSV tk的細(xì)胞，且具有顯著的旁觀者效應(yīng)(bystander effect, BSE).
無(wú)論是體外抑或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均觀察到，GCV劑量越大，培養(yǎng)中的HSV-tk+細(xì)胞被殺滅的比例和腫瘤退縮率也越高，荷HSV-tk+瘤的動(dòng)物生存期也越長(zhǎng). 至于HSV-tk本身的表達(dá)水平，一般與對(duì)GCV的敏感性不具有相關(guān)性，但不完全如此. 此外，細(xì)胞對(duì)HSV-tk/GCV的敏感性尚取決于擔(dān)負(fù)著GCV二-和三磷酸化的細(xì)胞激酶的活性、細(xì)胞增殖速率以及將GCV-TP整合入DNA的DNA聚合酶活性［11］. 有人認(rèn)為，GCV被HSV-tk+細(xì)胞攝取較慢，親和力較差，不是很理想的HSV-tk基質(zhì)［12］. Balzarini et al［13］發(fā)現(xiàn)，Elaidic acid ester GCV(E-GCV)的代謝物在HSV-tk+細(xì)胞內(nèi)停留時(shí)間較GCV代謝物長(zhǎng)1倍以上，且E-GCV在血漿中較GCV穩(wěn)定，因此如用作HSV-tk系統(tǒng)的前藥，其作用至少比GCV強(qiáng)10倍；Tong et al［14］發(fā)現(xiàn)，如果用無(wú)環(huán)鳥苷(acyclovir, ACV)代替GCV作為前藥，并使用較GCV常用劑量高2.5～5.0倍的劑量，則引致的旁觀者效應(yīng)明顯高于應(yīng)用GCV作為前藥時(shí).
1.2 帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)系統(tǒng) 與HSV-tk不同，帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(varicella zoster virus thymidine kinase， VZV-tk)對(duì)GCV親和性甚弱，而對(duì)前藥阿糖甲氧基嘌呤(6-methoxypurine arabinside, Ara-M)和溴乙烯基脫氧尿嘧啶(E)-5(2-bromovinyl)-2＇-deoxyuridine ,BVdU)具有親和力，能選擇性催化二者磷酸化，再在細(xì)胞內(nèi)酶作用下，最后生成三磷酸鹽，分別為Ara-ATP和BVdU-TP［15］. 野生型細(xì)胞對(duì)高達(dá)1500μmol/L濃度的Ara-A和75μmol/L～250μmol/L濃度的BVdU均不敏感，而對(duì)表達(dá)VZV-tk的細(xì)胞，低至1μmol/L～100μmol/L濃度的Ara-M和0.06μmol/L～0.6μmol/L的BVdU即呈細(xì)胞毒性［16］.
1.3 胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系統(tǒng) 胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase, CD)系由大腸桿菌和某些霉菌表達(dá)的一種酶，不存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，能催化胞嘧啶生成尿嘧啶. 抗霉菌藥5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5FC)經(jīng)CD脫氨后，生成5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU)，再經(jīng)細(xì)菌內(nèi)酶作用，生成氟脲嘧啶三磷酸鹽(5-fluoro-5＇-trip hosphate)和氟脫氧尿嘧啶單磷酸鹽(5-fluoro-2＇-deoxyuridine-5＇-monophosphate, FdUMP). 后二者抑制胸苷酸合成酶(thynidylate synthase)，阻抑DNA，RNA和蛋白合成，引致細(xì)胞死亡. 一般選用大腸桿菌的CD基因作為自殺基因. 應(yīng)用5FC作為前藥，有不少優(yōu)點(diǎn)，例如，人的細(xì)胞酶不能使5FC脫氨，因此在通常劑量下5FC幾無(wú)毒性；口服吸收良好(＞80%)；能透過(guò)血腦屏障等［1］. 表達(dá)CD的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞在暴露于5FC后. 細(xì)胞內(nèi)迅速產(chǎn)生可測(cè)定水平的5FC，胸苷酸合成酶受抑，廣泛形成RNA皺縮物(RNA adduts). 由CD/5FC介導(dǎo)的細(xì)胞死亡發(fā)生較HSV-tk/GCV引起者為慢［17］，可能由于5FC被攝取和轉(zhuǎn)化較慢所致. 但CD/5FC引起的細(xì)胞殺死作用不一定弱于HSV-tk/GCV，主要由于前者往往有更強(qiáng)的旁觀者作用. 如同HSV-tk/GCV一樣，前藥5FC的細(xì)胞毒性作用也呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，在某些敏感的細(xì)胞系如結(jié)腸癌，細(xì)胞毒性與CD表達(dá)呈正相關(guān)［18］，但在對(duì)5FU不敏感的肉瘤細(xì)胞，此種相關(guān)性不明顯，看來(lái)，細(xì)胞毒作用的強(qiáng)弱可能最終取決于特殊細(xì)胞系對(duì)5FU的內(nèi)在敏感性. CD/5-FC系統(tǒng)也顯示旁觀者效應(yīng)，與HSV/GCV時(shí)相似，但機(jī)制不同［19］.
1.4 細(xì)胞色素P450微粒體酶CYP2B1/環(huán)磷酰胺(CYP2B1/CPA)系統(tǒng) 自大鼠肝分離出的細(xì)胞色素P450微粒體酶CYP2B1，能催化化療藥環(huán)磷酰胺(CPA)和異環(huán)磷酰胺(IFF)，生成4羥環(huán)磷酰胺(4HC)，再迅速轉(zhuǎn)化為短壽命的烷基化物磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard)，引致細(xì)胞DNA損傷. 在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染CYP2B1基因的細(xì)胞對(duì)CPA的敏感性較野生型細(xì)胞高15倍～20倍. 該系統(tǒng)具有中等強(qiáng)度的旁觀者效應(yīng). 該系統(tǒng)對(duì)累及某些特殊部位如腦、腦膜的腫瘤可能具有特殊作用. CPA能自由地透過(guò)血腦屏障，但CPA轉(zhuǎn)化為4HC主要發(fā)生于肝內(nèi)，而4HC不易透過(guò)血腦屏障. 如將CYP2B1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腦瘤內(nèi)，再給予CPA，則局部生成的4HC可對(duì)腦瘤發(fā)揮細(xì)胞毒作用. 在進(jìn)行自身骨髓移植的腫瘤患者，可利用CYP2B1/CPA清除骨髓內(nèi)瘤細(xì)胞. 4HC對(duì)正常造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均有毒性，如將表達(dá)CYP2B1的腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓，由于造血細(xì)胞缺乏腺病毒表面受體，因此僅有腫瘤細(xì)胞被CYP2B1基因有效地轉(zhuǎn)染，從而被毒性4HC殺滅，而正常造血細(xì)胞不受危害［1］.
1.5 細(xì)胞色素P450 CYP4B1/氨基蒽(CYP4B1/2AA)系統(tǒng) 免細(xì)胞色素P450 CYP4B1能選擇性作用于前藥氨基蒽(2-aminoanthracene, ZAA)或4-ipomeanol (4-IM)，使之轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)烷化劑不飽和性或乙醛呋喃環(huán)氧化物(aldehyde furan epoxide［20］). 此種活化藥物在很低濃度即顯示高度DNA毒性. 體外實(shí)驗(yàn)表明，只要有1%的細(xì)胞表達(dá)CYB4B1，即有顯著的旁觀者效應(yīng).
1.6 脫氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dCK/Ara-C)系統(tǒng) 臨床上發(fā)現(xiàn)，抗白血病的核苷酸類藥物如阿糖胞苷(Ara-C)、2-氯脫氧腺苷(2CdA)和fludarabine的效應(yīng)與白血病細(xì)胞表達(dá)脫氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, dCK)的水平相關(guān). 這些前藥在細(xì)胞內(nèi)活化的關(guān)鍵步驟是被dCK磷酸化. Ara-C雖為造血系統(tǒng)惡性腫瘤的有效藥物，但對(duì)實(shí)體腫瘤作用有限. 人dCK能將Ara-C在細(xì)胞內(nèi)磷酸化，使其細(xì)胞毒性增加. 有人用逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒，將dCK基因轉(zhuǎn)染至神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，使這些瘤細(xì)胞對(duì)Ara-C敏感性明顯提高［21］.
1.7 烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶/6-硫黃嘌呤(gpt/6TX)系統(tǒng) 大腸桿菌的烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(guanosine-xanthine phosphoribosyl transferase, gpt)基因表達(dá)產(chǎn)物，既能增強(qiáng)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)硫黃嘌呤的敏感性，也能增強(qiáng)對(duì)mycophenolic acid、黃嘌呤和次嘌黃嘌呤的抗性，從而可對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行正、負(fù)選擇. gpt能使6-硫黃嘌呤(6-thioxanthine, 6TX)和6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine, 6-TG)磷酸化，增加轉(zhuǎn)染gpt基因細(xì)胞對(duì)該兩種前藥的敏感性. 鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞被逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染gpt基因后，對(duì)6-TX的敏感性提高50倍～100倍.［22］. 給予無(wú)胸腺鼠顱內(nèi)C6腫瘤內(nèi)移植gpt-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生細(xì)胞，隨后給予6TX，引起腫瘤縮小80%，生存期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)［23］.
1.8 硝基還原酶/CB1954(NTR/CB1954)系統(tǒng) 大腸桿菌的硝基還原酶(nitroreductase, NTR)對(duì)基質(zhì)5-(aziridin-1-yl)-2, 4-dinitrobenzamide (CB1954)具有高度催化活性，能迅速將其還原為一系列羥胺類烷化劑. 表達(dá)NTR的細(xì)胞對(duì)CB1954的敏感性較野生型細(xì)胞高500倍，且具有強(qiáng)大旁觀者效應(yīng)［24，25］. NTR也能激活一些抗菌藥如硝基呋喃妥英(nitrofuratoin)和甲硝唑，使之具有細(xì)胞毒性，但不顯示旁觀者效應(yīng)［25］.
1.9 嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脫氧核苷(PNP/6-MeP-dR)系統(tǒng) 大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)基因編碼的酶能激活相對(duì)無(wú)毒性的6-甲基嘌呤脫氧核苷(6-methyl purine-deoxyriboside, 6-MeP-dR)，生成高毒性的6-甲基嘌呤(6-methylpurine, 6-MeP). 用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將PNP基因轉(zhuǎn)達(dá)給小鼠黑素瘤和乳癌細(xì)胞，再暴露于6-MeP-dR，發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞被選擇性殺滅. 該系統(tǒng)具有強(qiáng)大旁觀者效應(yīng)，只要有1%的細(xì)胞表達(dá)PNP，即可引起大多數(shù)非轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡.
1.10 胸腺嘧啶磷酸化酶/5＇-脫氧-5-氟尿嘧啶(TP/5＇-DFUR)系統(tǒng) 胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP)能催化胸腺嘧啶或脫氧尿嘧啶，生成1-磷酸脫氧核糖. 對(duì)于前藥5＇-脫氧-5氟尿嘧啶(5＇-deoxy-5-fluorouridine, 5＇-DFUR)或1-(tetrahydrofuryl-5-fluorouracil, Tegafur), TP使之轉(zhuǎn)化為5FU. 業(yè)已證明該系統(tǒng)可使人MCF-7乳癌細(xì)胞對(duì)5＇-DFUR的敏感性提高1000倍. 該系統(tǒng)也呈旁觀者效應(yīng).
1.11 羧基肽酶G2/CMDA系統(tǒng)(CPG2/CMDA) 假單胞菌屬(Pseudomonas)RS16產(chǎn)生的羧基肽酶G2(carboxy peptidase G2，CPG2)可使4-(［2-chloroethyl］［2-mesyloxyethyl］amino)benzyol-L-glutamic acid(CMDA)分解為苯甲酸衍生物，后者為強(qiáng)毒性烷化劑. CMDA不易進(jìn)入細(xì)胞，不能被細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CPG2活化，但如果應(yīng)用基因工程方法讓CPG2在細(xì)胞膜表面表達(dá)，則CMDA便易被激活，從而顯示細(xì)胞毒性［26］.
1.12 羧酸酯酶/CPT-11(CE/CPT-11)系統(tǒng) 兔羧酸酯酶(carboxylesterase, CE)能使化療藥CPT-11(irinotecan, 7-ethyl-10-［4-(1-piperidino)-1-piperidino］ carbonyloxycamptothecin)轉(zhuǎn)化為其活性形式SN38(7-ethyl-10 hydroxycamptothecin)［27］. 人橫紋肌肉瘤細(xì)胞被免CE基因轉(zhuǎn)染后，對(duì)CPT-11的敏感性較之野生型細(xì)胞高8倍以上. 從CPT-11轉(zhuǎn)化為SN38的過(guò)程具有同工酶特異性，在人，主要由肝內(nèi)CE-Ⅰ催化.
1.13 復(fù)合系統(tǒng) 聯(lián)合應(yīng)用不同的自殺基因前藥系統(tǒng)可能比單一系統(tǒng)更有效［28，29］. 例如，聯(lián)合應(yīng)用CD/5FC和HSV-tk/GCV系統(tǒng)，前者產(chǎn)生的5FU可抑制胸苷酸合成酶，減少胸腺嘧啶生成，相應(yīng)減少在HSV-tk活性部位胸腺嘧啶和GCV的競(jìng)爭(zhēng)，從面增強(qiáng)HSV-tk/GCV系統(tǒng)的效應(yīng). 給鼠9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤同時(shí)轉(zhuǎn)染CD和HSV-tk兩種基因，可使殺滅腫瘤所需的5FC和GCV最低濃度下降50%以上.
2 作用機(jī)制
基因轉(zhuǎn)移載體將自殺基因轉(zhuǎn)染給腫瘤細(xì)胞，在自殺基因表達(dá)的特殊酶作用下，本身無(wú)毒或微毒的前藥在局部被激活，轉(zhuǎn)化為高度毒性藥物，從而將瘤細(xì)胞毒殺滅. 表達(dá)這種酶的瘤細(xì)胞越多，被殺滅的細(xì)胞越多. 此為直接細(xì)胞毒效應(yīng). 但實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，為了取得腫瘤退縮，并不需要每個(gè)腫瘤細(xì)胞均表達(dá)自殺基因，換言之，在自殺基因/前藥系統(tǒng)介導(dǎo)的腫瘤治療中，被殺滅的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)超過(guò)表達(dá)自殺基因的細(xì)胞數(shù). 這是由于在前藥存在下，基因改造的瘤細(xì)胞能引起未經(jīng)基因改造細(xì)胞的細(xì)胞毒性和死亡. 這種現(xiàn)象即前已述及的旁觀者效應(yīng)(bystander effect, BSE). 此種效應(yīng)有力的增強(qiáng)了自殺基因/前藥系統(tǒng)的作用，但因細(xì)胞系和酶/前藥不同而差異很大，可以不存在，也可以很強(qiáng)大，以致腫瘤內(nèi)只要有1%～5%的轉(zhuǎn)染細(xì)胞即可引起幾乎全部瘤細(xì)胞死亡. 前述的各系統(tǒng)中，許多均顯示這種效應(yīng). BSE產(chǎn)生的機(jī)制尚不完全清楚，主要有：
2.1 單純彌散作用 某些激活的前藥(如5FU)為可溶性分子，可自由地在細(xì)胞-細(xì)胞之間彌散，從而引發(fā)BSE. 在CD/5FU系統(tǒng)，暴露于5FU后，CD+細(xì)胞培養(yǎng)液中很快可測(cè)出5FU. 在細(xì)胞水平，BSE取決于5FC被基因改造細(xì)胞轉(zhuǎn)化為5FU的速率、5FU彌散至鄰近未基因改造細(xì)胞的速率，以及靶細(xì)胞對(duì)5FU的內(nèi)在敏感性. 如果腫瘤細(xì)胞本身對(duì)5FU敏感，則從鄰近基因改造細(xì)胞彌散而來(lái)的5FU，即使?jié)舛群艿�，也呈現(xiàn)細(xì)胞毒作用.
2.2 代謝協(xié)作作用(metabolic cooperation) 在某些自殺基因系統(tǒng)，例如HSV-tk/GCV，活化的前藥GCV-TP為荷電分子，不能被動(dòng)地穿越細(xì)胞膜，但在HSV-tk+細(xì)胞和野生型細(xì)胞共培養(yǎng)中，卻在后一種細(xì)胞內(nèi)顯示有高濃度GCV-TP［30］. 現(xiàn)認(rèn)為，這是HSV tk+細(xì)胞內(nèi)GCV-TP經(jīng)過(guò)細(xì)胞的裂隙連接(gap junction)轉(zhuǎn)移給野生型細(xì)胞的結(jié)果. 裂隙連接系由結(jié)合蛋白(connexons)組成的特殊細(xì)胞膜結(jié)構(gòu). 結(jié)合蛋白由connexins裝配而成，為一六聚體圓柱形蛋白，中心有孔道. 不同細(xì)胞之間的裂隙連接形成“代謝協(xié)作”管道，經(jīng)過(guò)此管道，一些小電荷分子能在細(xì)胞間流動(dòng). GCV-TP分子甚小(＜1000)，能透過(guò)裂隙連接. 業(yè)已證實(shí)，在HSV-tk/GCV系統(tǒng)中，細(xì)胞-細(xì)胞接觸是細(xì)胞殺滅作用所必需；細(xì)胞間裂隙連接與BSE強(qiáng)弱密切相關(guān)，而裂隙連接的透過(guò)性又與connexins 43,37,32和26的表達(dá)水平有關(guān). 缺乏BSE的細(xì)胞系在轉(zhuǎn)入connexins 43基因后，顯示BSE. 胰癌細(xì)胞呈現(xiàn)的BSE強(qiáng)于某些胃腸癌細(xì)胞，前者的connexins 43和connexins 26 mRNA表達(dá)水平，比后者分別高8倍～26倍和2倍～229倍［31］. 為了強(qiáng)化BSE，可通過(guò)藥理學(xué)方法疏通裂隙連接或增強(qiáng)其表達(dá). 由HSV-tk+和野生型腫瘤細(xì)胞混合物構(gòu)建的鼠間質(zhì)細(xì)胞瘤，如果同時(shí)接受GCV和維生素A酸(retinoid acid)，其腫瘤消退作用加快，這種作用即使在HSV-tk+細(xì)胞與野生型細(xì)胞的比例低至1∶40時(shí)仍存在. 已知維生素A酸能增加connexins 43的表達(dá)，促進(jìn)小分子色素在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，而其本身對(duì)腫瘤大小并無(wú)影響，由此推測(cè)，維生素A酸之所以能強(qiáng)化HSV-tk/GCV的作用，系由于其能加強(qiáng)裂隙連接的透過(guò)性，強(qiáng)化BSE所致［32］. 其他能增強(qiáng)HSV-tk/GCV BSE殺傷作用的物質(zhì)尚有黃酮類apigenin、膽固醇合成抑制劑lovastatin. 已知細(xì)胞酪氨酸激酶能使connexins磷酸化，減弱裂隙連接的透過(guò)性，而lovastatin能抑制該酶活性，從而增強(qiáng)裂隙連接的通透性：apigenin可能會(huì)增加裂隙連接的表達(dá). 相反，cAMP活化劑forskolin和鈣通道阻滯劑硝苯吡啶能減弱BSE.
2.3 免疫介導(dǎo)作用 給動(dòng)物在兩個(gè)不同部位分別移植HSV-tk+腫瘤和野生型腫瘤，再給予GCV，發(fā)現(xiàn)野生型腫瘤也退縮，這種現(xiàn)象稱為“距離性旁觀者效應(yīng)”(“bystander effect at a distance”)，提示體內(nèi)出現(xiàn)抗腫瘤性免疫反應(yīng)［33］. 下列事實(shí)提示這種免疫反應(yīng)的存在：①給小鼠植入含有HSV-tk+和野生型細(xì)胞的腫瘤，再接受亞致死量照射，發(fā)現(xiàn)BSE減弱；②在免疫缺陷性荷瘤BALB/c小鼠，HSV-tk/GCV的BSE弱于免疫功能正常的荷瘤鼠；③接受HSV-tk/GCV治療的荷瘤動(dòng)物，對(duì)同源腫瘤的再接種呈現(xiàn)特異性抗體反應(yīng)［34］；④前列腺癌鼠模型接受HSV-tk/GCV治療期間，如果去除自然殺傷細(xì)胞(NK)，則原發(fā)腫瘤的抑制作用減少20%，肺轉(zhuǎn)移癌的生長(zhǎng)不能被抑制［35］；⑤HSV-tk/GCV介導(dǎo)的腫瘤壞死伴有明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，CD4+和CD+8T細(xì)胞集聚、瘤內(nèi)白介素-12(IL-12)水平增高，這與環(huán)磷酰胺引起的壞死不同，后者缺乏炎癥反應(yīng)［34］. 自殺基因/前藥促發(fā)的免疫反應(yīng)的原理尚不清楚，可能由于腫瘤細(xì)胞壞死后，抗原成分更多地暴露，或在對(duì)壞死細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中，抗原提呈細(xì)胞得到補(bǔ)充或激活，從而引發(fā)延遲型腫瘤免疫反應(yīng)，如同體內(nèi)產(chǎn)生活的抗腫瘤疫苗. 有人認(rèn)為CD基因表達(dá)的CD蛋白本身具有超級(jí)免疫原性，可刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng). 進(jìn)一步研究表明，免疫反應(yīng)的出現(xiàn)與細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān). HSV-tk+細(xì)胞暴露于GCV后，體內(nèi)α腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)、IL-6、γ干擾素(IFN-γ)和粒細(xì)胞菌落刺激因子(GM-CSF)水平均提高；HSV-tk+細(xì)胞表面共刺激性分子(costimulating molecules)ICAM和B7的表達(dá)增加. 有人發(fā)現(xiàn)，如果免疫缺陷性HSV-tk載體同時(shí)表達(dá)TNF-α，則HSV-tk/GCV抗腫瘤效應(yīng)明顯提高.
2.4 其他作用 有人認(rèn)為，死亡的HSV-tk+細(xì)胞可釋放含GCV-TP凋亡囊泡，野生型腫瘤細(xì)胞吞噬這些囊泡后會(huì)死亡. 但這些囊泡出現(xiàn)較遲，不能解釋早期發(fā)生的BSE. 有人認(rèn)為HSV-tk/GCV可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞基因改造，通過(guò)對(duì)腫瘤血管的破壞而引發(fā)BSE［36］. 已知轉(zhuǎn)染HSV-tk基因的大鼠腦瘤，在暴露于GCV后，瘤內(nèi)血管明顯減少.
3 消化系腫瘤的治療
迄今，已在許多腫瘤試驗(yàn)了自殺基因療法的治療作用，這些腫瘤包括黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、間皮瘤、肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌、腹膜癌、宮頸癌等，但多半為體內(nèi)、外臨床前研究，真正進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ期研究的僅見(jiàn)于惡性胸膜間皮瘤(美國(guó))、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤(法國(guó))等少數(shù)腫瘤. 在消化系腫瘤中，研究較多的是關(guān)于HSV-tk/GCV和CD/5FC對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、胰癌和胃癌的治療作用.
3.1 肝癌 1993年Caruso et al［37］首先報(bào)告向大鼠實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移性肝癌組織內(nèi)，注入含有表達(dá)HSV-tk重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞，再給予GCV，引起腫瘤明顯退縮，瘤細(xì)胞數(shù)平均減至對(duì)照組的1/60. 應(yīng)用重組腺病毒作為HSK-tk基因的載體，也得出類似結(jié)果. Kwong et al［38］給鼠肝植入乳腺癌細(xì)胞，制造實(shí)驗(yàn)性肝癌，2wk后，瘤內(nèi)注入表達(dá)HSV-tk的復(fù)制缺陷性腺病毒載體，結(jié)果顯示腫瘤明顯退縮，生存期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.01). HSV-tk/GCV可能特別適于治療肝腫瘤，這是因?yàn)椋孩傺杆俜至训哪[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于非增生性、相對(duì)正常的肝組織中，而用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)增殖旺盛的細(xì)胞最有親和力. 體外實(shí)驗(yàn)表明，HSV-tk基因轉(zhuǎn)染的肝腫瘤細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性是野生型細(xì)胞的500倍～1000倍［39］；②由于70%的肝細(xì)胞癌表達(dá)甲胎蛋白(AFP)，而正常肝細(xì)胞不表達(dá)此種蛋白，因此如應(yīng)用AFP基因作為啟動(dòng)子，可提高基因轉(zhuǎn)錄載體的靶向性，增加目的基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的效果［6，39-41］；③，由于肝腫瘤的血液供應(yīng)主要來(lái)自肝動(dòng)脈，因此如果從肝動(dòng)脈輸注基因轉(zhuǎn)移載體和前藥，可能進(jìn)一步增加基因轉(zhuǎn)移的靶向性，減少副作用［39］. Gerolami et al［42］在二乙基硝胺肝癌鼠模型，比較了經(jīng)門脈、肝動(dòng)脈和瘤內(nèi)直接注射等3種途徑輸注重組腺病毒載體的效果，發(fā)現(xiàn)以肝動(dòng)脈輸注產(chǎn)生的腫瘤抑制效應(yīng)最顯著. HSV-tk/GCV對(duì)肝腫瘤的抑制作用尚見(jiàn)于肝外輸注自殺基因時(shí)，此很可能系“距離性旁觀者效應(yīng)”發(fā)揮了作用. 向鼠腹腔內(nèi)注入HSV-tk+和HSV-tk-結(jié)腸癌細(xì)胞，10d后，再向肝內(nèi)注入HSV-tk-結(jié)腸癌細(xì)胞，所有動(dòng)物均接受GCV. 結(jié)果顯示，不僅腹腔內(nèi)HSV-tk+腫瘤和HSV-tk-腫瘤相比，明顯退縮，而且肝內(nèi)HSV-tk-腫瘤在腹腔HSV-tk+腫瘤鼠也小于腹腔HSV-tk-腫瘤鼠. 腹腔HSV-tk+腫瘤鼠的肝內(nèi)腫瘤內(nèi)有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，伴纖維化，僅偶見(jiàn)存活的腫瘤細(xì)胞.
3.2 結(jié)直腸癌 CD/5FC系統(tǒng)看來(lái)更適合于治療結(jié)直腸癌. 體外實(shí)驗(yàn)表明培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中只要1/3表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(CD)，即足以使前藥5FC轉(zhuǎn)化為足夠濃度的5FC，而使全部癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制；皮下移植的結(jié)腸癌組織中只要2%的癌細(xì)胞表達(dá)CD，在給予5FC后，腫瘤生長(zhǎng)即完全停止. 如果將載有CD基因的腺病毒載體，直接注射入裸鼠皮下移植性結(jié)腸腫瘤內(nèi)，再給予5FC，引起腫瘤縮小3/4～4/5. Rowley et al［17］報(bào)告表達(dá)CD的結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5FC的敏感性，比不表達(dá)CD的腺癌細(xì)胞高200倍以上，在7d內(nèi)，90%以上癌細(xì)胞被殺死. 有人比較了經(jīng)基因改造的結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)前藥5FC或GCV的敏感性，發(fā)現(xiàn)GCV對(duì)HSV-tk+細(xì)胞的50%抑制濃度(IC50)為對(duì)野生型細(xì)胞的1/140，而5FC對(duì)CD+細(xì)胞的IC50僅為對(duì)野生型細(xì)胞的1/960；移植瘤內(nèi)如果HSV-tk+細(xì)胞少于10%，則不顯示抗腫瘤效應(yīng)，而CD+細(xì)胞僅需4%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)便受到抑制.
結(jié)直腸癌對(duì)CD/5FC更為敏感的原因可能為：①腫瘤本身對(duì)5FC具有內(nèi)在敏感性；②CD/5FC系統(tǒng)的旁觀者效應(yīng)(BSE)較顯著. 在此系統(tǒng)中，BSE不取決于細(xì)胞-細(xì)胞間接觸，而取決于5FC的細(xì)胞間自由彌散. 現(xiàn)認(rèn)為結(jié)直腸癌對(duì)HSV-tk/GCV的敏感性與癌細(xì)胞的類型有關(guān). Link et al［43］發(fā)現(xiàn)在由HSV-tk+和HSV-tk-結(jié)直腸癌細(xì)胞構(gòu)建的種植瘤，如果HSV-tk+細(xì)胞在全部癌細(xì)胞中占9%，在給予GCV后，發(fā)生腫瘤退縮；但某些類型HSV-tk+結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)GCV呈現(xiàn)抗性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞內(nèi)HSV/tk基因部分或完全性脫落，免疫組化研究顯示細(xì)胞內(nèi)HSV/tk蛋白缺乏［44］. McMaster et al［45］發(fā)現(xiàn)三種結(jié)腸癌細(xì)胞株中有二種在HSV-tk/GCV作用期間無(wú)明顯BSE發(fā)生. 分子雜交技術(shù)雖然在這些細(xì)胞測(cè)到裂隙連接蛋白connexin43，但免疫組化研究顯示，這種蛋白存在于細(xì)胞漿內(nèi)，而不是在細(xì)胞表面；相反，呈現(xiàn)強(qiáng)有力BSE的結(jié)直腸癌細(xì)胞表面有connexin43表達(dá). 由于細(xì)胞表面connexin43表達(dá)是HSV-tk/GCV治療時(shí)BSE發(fā)生的必要條件，因此某些類型結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)HSV-tk/GCV缺乏敏感性［31］，可能主要與BSE不足有關(guān)，這對(duì)基因治療方法和適合病例的選擇具有實(shí)際意義.
3.3 胰癌 1994年DiMaio et al用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將HSV-tk基因轉(zhuǎn)染胰癌細(xì)胞. 給免疫缺陷鼠皮下注射以各種比例混合的HSV-tk+和野生型胰癌細(xì)胞，全部動(dòng)物均發(fā)生胰癌. 給予GCV后，腫瘤明顯消退，即使僅含10% HSV-tk+細(xì)胞的腫瘤也顯示瘤體積明顯縮小. 應(yīng)用CEA基因作為啟動(dòng)子，可提高病毒載體將目的基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)CEA性胰癌細(xì)胞的耙向性. Ohashi et al［46］發(fā)現(xiàn)，用表達(dá)HSV-tk基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染胰癌細(xì)胞時(shí)，如采用一般的啟動(dòng)子，則癌細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性與CEA產(chǎn)生無(wú)關(guān)，如果采用CEA啟動(dòng)子，則GCV殺傷作用在產(chǎn)CEA細(xì)胞明顯增強(qiáng). 在胰癌的自殺基因/前藥治療中，BSE甚為顯著. Green et al［24］應(yīng)用硝基還原酶ND/CB1954系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)胰癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染ND基因后，對(duì)CB1954的敏感性提高500倍，在與野生型細(xì)胞混合培養(yǎng)中，只要10%的胰癌細(xì)胞表達(dá)ND，即足以引起強(qiáng)大BSE. 對(duì)于腹腔轉(zhuǎn)移性胰癌，腹腔內(nèi)輸注表達(dá)自殺基因的病毒載體，往往可有效地誘發(fā)BSE. Rosenfeld et al［47］給BALB/c裸鼠腹腔內(nèi)注入胰癌細(xì)胞誘發(fā)腫瘤形成，再注入表達(dá)HSV-tk基因的腺病毒載體，在注射GCV后，腫瘤明顯退縮，伴有強(qiáng)大BSE出現(xiàn). Aoki et al［48］作過(guò)類似實(shí)驗(yàn)， 但采用脂質(zhì)體作為載體，將HSV-tk基因注入腹腔，對(duì)照組24只鼠全部出現(xiàn)胰腫瘤伴腹腔播散，而治療組14只鼠中8只未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng).
3.4 胃癌 Yoshida et al［49］將包裝有HSV-tk基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞對(duì)GCV呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性反應(yīng)，在體外實(shí)驗(yàn)中低至0.1μg/mL的GCV即可將胃癌細(xì)胞殺滅；在13只皮下接種HSV-tk+胃癌細(xì)胞的裸鼠中，12只的腫瘤在給予GCV后顯著退縮. 與結(jié)直腸癌相似，胃癌對(duì)HSV-tk/GCV的敏感性也以產(chǎn)CEA細(xì)胞最高. Tanaka et al［50］應(yīng)用含CEA啟動(dòng)子的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染HSV-tk基因，發(fā)現(xiàn)腹腔注射這種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒后，30%產(chǎn)CEA性胃癌細(xì)胞選擇性表達(dá)HSV-tk基因，給予GCV后，腫瘤生長(zhǎng)較未給予GCV的對(duì)照組減少20%. 類似地，如果以CEA基因作為啟動(dòng)子，腺病毒載體也可將CD基因選擇性轉(zhuǎn)染于CEA陽(yáng)性胃癌細(xì)胞. 有人認(rèn)為，腹腔內(nèi)注射以CEA基因作為啟動(dòng)子的腺病毒介導(dǎo)的CD/5FU，可能是治療播散性胃癌的新途徑.
4 問(wèn)題和前景
4.1 安全性 由于本身無(wú)毒性的前藥，僅在表達(dá)自殺基因的瘤細(xì)胞內(nèi)才被轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)，引起后者局部高濃度，因此，在理論上，本療法不會(huì)引起全身性副作用. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明這種療法是安全的. 臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)同樣顯示本療法不會(huì)引起嚴(yán)重的副作用. Klatzmann et al用鼠細(xì)胞包裝表達(dá)HSV-tk基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后將這種鼠細(xì)胞注入黑素瘤瘤體內(nèi)，每次108～3×109細(xì)胞，共1次～3次，然后給予GCV 5mg/kg，2次/d，共14d. 共治療8例患者. 治療后3d～9d于注射局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，多數(shù)持續(xù)幾天后消失；伴中等度發(fā)熱，持續(xù)24h后自退. 無(wú)其他嚴(yán)重副反應(yīng). Klatzmann et al［51］在1998年又報(bào)告治療12例復(fù)發(fā)性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的結(jié)果. 在手術(shù)切除腫瘤后，于腔壁多部位注入含有HSV-tk+逆轉(zhuǎn)錄病毒的鼠Mll細(xì)胞8.7×106/cm2，7d后再輸注GCV 5mg/kg，2次/d共14d. 未見(jiàn)明顯副作用，無(wú)一例因此項(xiàng)治療而引發(fā)癥狀加劇或死亡. Sterman et al［52］報(bào)告胸腔內(nèi)注射含HSV-tk基因的腺病毒載體，每次1012pfu，共治療12例胸膜間皮瘤患者. 多數(shù)患者在6h～12h內(nèi)輕度發(fā)熱，48h～72h后消退，1例出現(xiàn)急性胸膜炎癥狀. 無(wú)明顯血液學(xué)異常. 胸腔插管周圍常發(fā)生皮疹，但不治而愈.
病毒載體可否在體內(nèi)重新獲得復(fù)制能力，而引發(fā)播散性病毒感染自殺基因能否轉(zhuǎn)染非靶細(xì)胞，而引起各臟器損害目前的資料均持否定的看法. Klatzmann et al［51］曾在治療的1例患者中測(cè)到HSV-tk基因，但為一過(guò)性，未引起不良后果. 值得注意的是自殺基因療法治療肝癌，對(duì)肝功能有無(wú)影響尚有不同看法. Qian et al［53］發(fā)現(xiàn)在二乙基硝胺(DENA)誘發(fā)的鼠肝癌，HSV-tk/GCV治療后，在腫瘤退縮的同時(shí)，血清轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，肝組織呈彌漫性損害. 但這可能由于DENA誘發(fā)的細(xì)胞增生，不僅見(jiàn)于肝癌結(jié)節(jié)，也發(fā)生于非癌性肝實(shí)質(zhì)，以致非腫瘤性細(xì)胞也被HSV-tk基因轉(zhuǎn)染，而對(duì)GCV呈現(xiàn)敏感性. van de Eb et al［54］報(bào)告正常的非有絲分裂肝細(xì)胞能被表達(dá)HSV-tk的腺病毒載體轉(zhuǎn)染，以致在HSV-tk/GCV 治療后可發(fā)生嚴(yán)重肝功能異常. 但其他學(xué)者則認(rèn)為該療法對(duì)肝無(wú)明顯副作用，肝癌組織內(nèi)發(fā)生的旁觀者效應(yīng)不會(huì)波及腫瘤外肝組織.
4.2 展望 自殺基因/前藥療法可使前藥在表達(dá)自殺基因的腫瘤內(nèi)，轉(zhuǎn)為高效毒性物質(zhì)，通過(guò)直接細(xì)胞毒性或旁觀者效應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用. 如果基因靶向表達(dá)能夠?qū)崿F(xiàn)，則不僅正常組織免受損傷，而且可清除無(wú)法手術(shù)切除的癌灶或轉(zhuǎn)移灶. 但迄今為止，該療法主要尚處于臨床前試驗(yàn)階段，僅有少數(shù)進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)，療效也難稱滿意. 提高療效的關(guān)鍵看來(lái)是真正做到靶向表達(dá). 雖然某些腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的自殺基因可轉(zhuǎn)染特殊瘤細(xì)胞內(nèi)，但這種特異性是相對(duì)的，也可轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞；而且，病毒載體在腫瘤組織內(nèi)不可能均勻分布，更不可能轉(zhuǎn)染每個(gè)腫瘤細(xì)胞. 為了提高靶向性，有人主張采用復(fù)制型而不采用免疫缺陷性病毒載體，認(rèn)為前者可在腫瘤內(nèi)形成次級(jí)循環(huán)感染(secondary round of infection)［1］，提高轉(zhuǎn)染效果；也有人主張采用不同的病毒載體，以轉(zhuǎn)染不同類型的腫瘤組織或同一類型腫瘤的不同細(xì)胞. 由于病毒載體引入機(jī)體后，可誘發(fā)抗病毒抗體，而影響病毒載體的轉(zhuǎn)染效果，因此采用不同的病毒載體尚有可能進(jìn)行反復(fù)治療.
努力提高旁觀者效應(yīng)(BSE)，對(duì)增強(qiáng)自殺基因/前藥療效有重要意義. 自殺基因/前藥系統(tǒng)不同，BSE的機(jī)制也可不同，例如HSV-tk/GCV系統(tǒng)的BSE有賴于細(xì)胞裂隙連接的表達(dá)，而某些腫瘤不表達(dá)或甚少表達(dá)裂隙連接，顯然不適于HSV-tk/GCV療法，因此，篩選適合某一療法的腫瘤甚為重要；也可應(yīng)用藥物促進(jìn)裂隙連接的表達(dá). 前藥的選擇也很重要，應(yīng)發(fā)展新的半壽期長(zhǎng)的高效前藥，并探討最適劑量和給藥方式. 此外，聯(lián)合應(yīng)用不同的自殺基因/前藥系統(tǒng)，將自殺基因和細(xì)胞因子基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染入腫瘤，或聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)抗癌療法或免疫促進(jìn)因子，以形成疊加殺傷效應(yīng)，等，均是目前正在研究的課題. 相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，自殺基因療法一定會(huì)有新的突破.
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