|
關(guān)鍵詞： 肝硬變；治療；基因療法
肝硬變是慢性肝病晚期的組織學改變，表現(xiàn)為肝實質(zhì)細胞廣泛破壞和再生，纖維結(jié)締組織大量增生造成肝小葉和血管結(jié)構(gòu)的無序化，結(jié)果常引起肝功能失代償、食管靜脈曲張、腹水和肝癌等致死性并發(fā)癥．長期以來，對肝纖維化和肝硬變?nèi)狈τ行У闹委煼椒ǎ陙黼S著分子生物學的發(fā)展，初步闡明了肝硬變發(fā)病機制，從而在基因水平上治療肝纖維化的研究取得重大進展[1-3].現(xiàn)綜述如下．1肝硬變的發(fā)病機制引起人體肝硬變的原因很多、涉及的發(fā)病機制復雜[3-5]．在實驗中通常應用四氯化碳(CCl4)或二甲基亞硝胺(DMN)誘導的大鼠肝硬變模型研究相關(guān)的發(fā)病機制，因為其特點與人肝纖維化和肝硬變的病理相似：肝臟實質(zhì)細胞塌陷，形成了由纖維間隔分離開的再生結(jié)節(jié)，網(wǎng)硬纖維(reticulinfibers)呈放射狀分布于整個肝臟。如果不及時進行治療，通常大鼠7wk內(nèi)死于廣泛性肝纖維化和肝功能失代償[1,6].雖然肝硬變的分子機制尚未完全弄清，但是已證實DMN誘導肝細胞脂肪的降解，貯脂細胞(Ito細胞)的激活和增生，Kupffer細胞的浸潤和TGF-β的分泌．現(xiàn)認為肝竇周間隙的星狀細胞(又叫做Ito細胞、貯存細胞)在肝纖維化過程中起主要作用，在肝損傷和傷，愈合的過程中，它經(jīng)歷了顯著的形態(tài)學和功能上的變化，后者又稱為“激活”，產(chǎn)生應激纖維和大量的細胞外基質(zhì)(ECM)．尤其是在DMN誘導肝損傷過程中大量產(chǎn)生TGF-β1，后者是一種致纖維化的細胞因子，它主要是刺激肝星狀細胞合成ECM，此外TGF-β1還與另外一些細胞因子(血小板衍生生長因子PDGF)、小分子的多肽等一起在纖維化的進展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[5-7]．有關(guān)作用機制不僅涉及到TG-β1誘導肝星狀細胞向肌纖維樣母細胞轉(zhuǎn)化，后者促進了細胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生，減少了細胞外基質(zhì)蛋白的降解，而且TGF-β1、還能較強的抑制表皮細胞、內(nèi)皮細胞(包括肝細胞)的生長，特別是TGF-β1誘導肝細胞的程序性死亡(凋亡)．在TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠中，同樣證實高水平的TGF-β1，表達，使小鼠易發(fā)生肝纖維化．由此可以設想：凡具有影響星狀細胞的激活和抗TGF-β1生物學活性藥物，就有可能阻止肝纖維化進程，同時有利于肝細胞的再生、阻止肝細胞凋亡和損傷，對肝纖維化具有治療和預防作用[1，6-8]．由于ECM還可能和整合素(integrin)相互作用，從而影響有關(guān)細胞的結(jié)構(gòu)、功能，誘導基因表達、刺激細胞的增殖．此外，蝶氏(Disse)間隙的纖維化(如膠原纖維和纖雛結(jié)合素的聚積)可能阻斷了肝竇狀間隙和肝細胞之間的分子交換，同時捐害了肝細胞的功能，所以減輕Disse間隙的纖維化更有效的改善肝功能．即使在肝硬變晚期減輕的肝纖維化可能緩解肝臟的損害，所以有助于減輕肝功能失代償?shù)某潭萚9]。2基因治療的方案2．1阻斷TGF-β信號傳導的治療方案由于TGF-β是一種重要的細胞因子，它參與細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、降解和聚集的一系列過程，因而與纖雛增生有重要關(guān)系[7，10，11]．通過研究抗TGF-β作用將會有效地阻斷纖維化的過程，為此，Qietal首先重組了腺病毒載體AdCATβ-TR，目的是表達截斷的人Ⅱ型TGF-β受體，阻斷丁TGF-β信號傳導,他們應用AdCATβ-TR(109pfu／Ml)從門靜脈一次性輸入的，再用DMN誘導肝臟纖雛化的模型．3d后，應用Northern雜交檢測發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟中截短的人TGF-β受體表達水平大約是對照組(經(jīng)過生理鹽水和AdCALacZ治療)的20倍．通過免疫組化檢測顯示在AdCVTβ-TR治療的大鼠肝組織中，I型膠原、纖維結(jié)合素(fibronectin)，a-SMN,TGF-β等表達均受到抑制．通常血清透明質(zhì)酸的水產(chǎn)是反映患者肝纖維化進展的指標。經(jīng)過AdCATβ-TR治療的大鼠，血清透明質(zhì)酸水平低，而且血清ALT水平也降低了60倍．而對照組血清透明質(zhì)酸水平卻很高，而且在3wk內(nèi)均死于肝纖維化和肝功能衰竭．所以本實驗的重要發(fā)現(xiàn)在于，在抗TGF-β信號傳遞過程中，終止了肝纖維化的進程、同時伴隨著肝功能改善、體重損失緩解和存活時間延長。由此可見Qietal應用腺病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移阻斷TGF-β的信號傳遞，阻斷了纖維化過程能保護肝功能，并具有治療效果，可見TGF-β的確在體內(nèi)纖維化過程中起著關(guān)鍵的作用[7]．因而可能是一種有效的、具有應用前景的治療方案[1，8]．2.2應用HGF基因治療方案由于肝細胞生長因子(HGF)在肝臟的發(fā)育和再生過程中起到不可缺少的作用，還具有抗肝細胞凋亡、激活廣泛細胞的有序分裂等活性，因此應用HGF基因轉(zhuǎn)移治療肝硬變、刺激肝再生也可能是合理的選擇，為此Fujimotoetal應用直接轉(zhuǎn)移基因HGF基因到骨骼肌細胞的方法對大鼠肝硬變實施新的基因治療[2，6，12，13]。他們建立了一種安全、簡單、重復性轉(zhuǎn)導HGF基因進入體內(nèi)骨骼肌的步驟，在DMN誘導的大鼠肝纖維化的wk4，應用肌肉注射HGF-HVJ脂質(zhì)體進行HGF轉(zhuǎn)基因治療后，大鼠血漿中人HGF和內(nèi)源性的鼠HGF大量上升，推測是人HGF基因轉(zhuǎn)移提高了大鼠的HGF的表達水平，C-Met基因編碼的HGF受體是酪氨酸激酶蛋白(HGFR)．其中的β鏈跨膜分布，含有胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶的功能區(qū)，在正常大鼠中，HGFR表達水平很低，在HGF-HVJ脂質(zhì)體治療的大鼠中，HGFR受體水平大量上升，并維持在較高水平．HGF的生物活性是通過HGFR的酪氨酸殘基磷酸化實現(xiàn)的。給大鼠連續(xù)的注射HGF-HVJ脂質(zhì)體以后，其肝臟中產(chǎn)生很強的HGFR酪氨酸磷酸化．上述結(jié)果表明：人HGF的基因轉(zhuǎn)移治療誘導了人HGF和內(nèi)源性大鼠HGF的高水平表達，也在很大程度上激活了肝硬變大鼠肝臟中HGF受體．值得重視的是在治療組，給每只大鼠轉(zhuǎn)染40μg的HGFDNA，可以完全緩解肝硬變，使大鼠免于死亡．在肝硬變的大鼠肝臟中，HGF刺激肝細胞有絲分裂，后者在肝臟再生的過程中起到重要作用．經(jīng)過HGF基因治療后，TGF-β1的表達受到強烈地抑制，其結(jié)果肝臟中肝星狀細胞向肌纖維樣母細胞轉(zhuǎn)化受阻，此外，膠原酶的活性增強，因而能觀察到肝硬變的Gilsson’s鞘和假小葉中纖維結(jié)蹄組織的增生也被抑制．組織學觀察表明門靜脈周圍和肝小葉中心的廣泛纖維化過程幾乎完全終止，肝小葉和血管的結(jié)構(gòu)得到了很好的重建，門脈高壓也得到顯著改善，可見基因治療的結(jié)果阻斷了纖維化進程，刺激了肝再生，重建了肝內(nèi)結(jié)構(gòu)，所有這些都是評價肝硬變治療的關(guān)鍵指標．應用TUNEL原位免疫組化測定發(fā)現(xiàn)在門脈周圍和肝小葉中心部位的纖維化減少，肝腺泡的變形減輕．應用影象分析技術(shù)定量檢測，發(fā)現(xiàn)肝臟纖維化減少70％．更重要的是HGF基因治療阻斷了DMN誘導的肝細胞的凋亡．值得注意的是所有對照組大鼠在DMN處理后的45d內(nèi)，均死于進行性肝硬變．經(jīng)證實HGF基因的轉(zhuǎn)導抑制了DMN誘導的TGF-β1的表達，所以，HGF基因治療療效的一部分是通過抑制TGFβ1來改善肝纖維化的病變．不過目前還不清楚HGF通過何種確切機制來抑制TGF-β1的表達和功能．在肝硬變的組織中，由肝星狀細胞轉(zhuǎn)化的肌纖雛樣細胞能特性表達a平滑肌肌動蛋白(a-SMA)，后者與TGF-β1，的表達有高度相關(guān)性．尤其是經(jīng)過HGF基因治療后，表達a-SMA的陽性細胞也大量地減少．Fijimoto研究了HGF對體外培養(yǎng)的非實質(zhì)肝細胞的影響，發(fā)現(xiàn)在體外條件下HGF能抑制TGF-β1Mrna和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生．為此，有必要進一步闡明HGF抑制TGF-β1的分子機制。據(jù)報道在腎細胞中，HGF呈上游調(diào)節(jié)，引起EDA區(qū)域產(chǎn)生大量的細胞纖維結(jié)合素，而在損傷的肝臟中，EDA纖維結(jié)合素的出現(xiàn)與纖維化有關(guān)，所以HGF影響星狀細胞、以及調(diào)節(jié)TGF-β和基質(zhì)蛋白的降解等有關(guān)的機制有待進一步弄清[14-16]。3不同基因治療方案的優(yōu)越性在理論上有效的抗纖維化治療需要符合以下幾個重要的條件：①有可靠而明確的生物學機制．②必須有藥效學上的優(yōu)勢．即活性成分在肝臟中能達到較高的濃度，對肝外組織影響少，如果作用的靶位是星狀肝細胞就更好．③治療的藥物應當在作用的靶環(huán)境中維持較長的時間，或許在損傷的部位無限期的存在[1]．Qietal報道的方法保證了將目的基因直接運送到肝臟，并獲得高水平的表達，重要的是在DMN引起肝臟損傷之前，表達截短的TGF-β受體的AdCATβ-TR就給大鼠預先進行注射，腺病毒載體能至少保持目的基因高效表達1wk～2wk，在DMN處理后的3wk中，產(chǎn)生高水平Ⅱ型TFG-β受體．應用腺病毒載體具有一定優(yōu)勢：①腺病毒對肝細胞有較高的親和性，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)導肝星狀細胞，所以腺病毒載體介導的外源基因易于進入肝星狀細胞以及鄰居區(qū)域的其他細胞(如肝細胞)．②應用腺病毒載體可減少對被治療的機體產(chǎn)生全身性毒性，因為經(jīng)過注射腺病毒后主要集中分布于肝臟．雖然不利的因素就是維持基因表達的時間較短，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有新的載體可維持靶基因長期的表達，或重復注射Liposome介導的基因表達也能達到此目的[1，8]．Fujimotoetal應用含有DNA和HVJ包膜蛋白的脂質(zhì)體，而將它們直接注射到骨骼肌，這樣表達的HGF能進入血液循環(huán)，到達肝臟發(fā)揮作用，由于這種方法簡便、安全、又沒有毒性，所以可以用于活的動物模型中．進而通過重復轉(zhuǎn)染HGF基因可以使血漿中HGF持續(xù)維持在較高的水平．實驗證實重復進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染不會引起顯著的炎癥反應和小鼠細胞和體液免疫系統(tǒng)的激活[1，2，6]．4應用前景目前，應用轉(zhuǎn)移外源基因進入肝臟的方法和載體系統(tǒng)還受到一定的限制．例如：腺病毒載體由于自身蛋白質(zhì)有較強的免疫原性而產(chǎn)生細胞毒性、逆轉(zhuǎn)病毒載體雖可用于轉(zhuǎn)移基因到部分切除(而產(chǎn)生再生的)肝臟，但轉(zhuǎn)染的效率相對較低．由于HVJ-脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移比直接注射裸DNA的效率更高，這一方法可能較合適應用于人體肝硬變的治療．上述研究表明抗肝硬變的基因治療能夠阻斷肝纖維化的發(fā)展、刺激肝細胞的增殖和恢復肝組織結(jié)構(gòu)的完整性，研究進展令人鼓舞．不過另一個值得考慮的重要問題是：抗纖維化的藥物有效性的判斷是基于實驗性肝損傷的基礎上，而且在肝損傷的最早期就進行治療，這對了解藥物的生物學活性及機制是有用的，但是：臨床上大多數(shù)患者通常是已經(jīng)有肝纖維化才前來就醫(yī)，這些患者肝臟正在發(fā)生進行性炎癥和肝纖雛化，應用上述治療能否有效，是值得深入研究的問題．在我國肝纖維化和肝硬變的發(fā)病串較高，其中引起肝硬變的主要原因可能是慢性病毒性肝炎．抗肝纖維化治療，一要抑制膠原生成、促進肝細胞增生；二是要促進已形成的膠原纖維降解和吸收．才能有效阻斷肝硬變的發(fā)生．其中特別是有效地抑制肝星狀細胞的激活是重要的一環(huán)[17]．在我國應用中醫(yī)中藥進行抗肝纖維化治療，取得一定的效果．由于應用常規(guī)的療法不能治愈肝纖維化和肝硬變，所以依靠基因分子生物學的進步，相信在不久的將來，應用HGF或(和)抗TGF-β的基因治療最終將成為臨床抗肝纖維化和肝硬變的治療方案
參考文獻：
�。�1］ Rockey DC Gene therapy for hepatic fibrosis-brining treatment into the new millennium.Hepatology,1999;30:816-818
�。�2］Fujimoto J,Kaneda Y.Reversing liver cirrhosis:impact of gene therapy for liver cirrhosis.Gene Ther,1999;6:305-306
�。�3］ Friedman SL.The cellular basis of hepatic fibrosis.mechanism and treatment strategies.N Engl J Med,1993;328:1828-1835
�。�4］ Inuzuka S,Ueno T,Torimura T,Tamaki S,Sugawara H,Sakata R,Kusaba N,Sata m,Tanikawa K.The significance of colocalization of plasminogen activator inhibitcr-1and vitronectin in hepatic fibrosis.Scand J gastroenterol,1997;32:1052-1060
�。�5］ Wu J,Zern MA,NF-kappa B,liposomes and pathogenesis of hepatic injury and fibrosis.Front Biosci,1999;15:D520-527
［6］Uleki T. Kaneda Y. Tsutsui H,Nakanishi K,Sawa Y,Morishita R,Matsumoto K. nakamura T,Takahashi H,Okamoto E,Fujimoto J.Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats.Nat Med,1999;5:226-230
�。�7］劉芳,劉金星.轉(zhuǎn)化生長因子β1在肝纖維化中的作用。世界華人消化雜志，2000；8：86-88
�。�8］ Qi Z, Atsuchi N, Ooshima A,Takeshita A,,Ueno H.Blockade of type beta transforming growth factor signaling prevents liver fibrosis and dysfunction in the rat. Proc Natl Acad Sci USA,1999;96:2345-2349
�。�9］ Prockop DJ,Kivirikko KI.Collagens:molecular biology,diseases,and potentials for thenapy Annu Rev Biochem,1995;64:403-434
�。�10］ Murawaki Y,Nishimura Y,Ikuta Y, Idobe Y,Kitamura Y, Kawasaki H Plasma transforming growth factor-beta 1 concentrations in patients with chronic viral hepatitis.J Gastroenterol Hepatol,1998;13:680-684
�。�11］ Bernasconi P,Torchiana E,Confalonier P,Brugnoni R,Barresi R,Mora M, comelio F,Morandi R,Mantegazza R.Expression of transforming growth factor-beta1in dystrophic patient muscles correlates w role of a fibrogenic cytokine.J Clin invest,1995;96:1137-114
�。�12］ascda Y, Matsumoto K,Yamada A,Ichida T,Asakura H,Komoriya Y,Nishiyama e,Nakamura T.Preventive and therapeutic effects in rats of Nishiyama E,Nakamura t.Preventive and therapeutic effects in rats of hepatocyte growth factor infusion on liver fibrosis/cirrhosis.Hepatology,1997;26:81-89
�。�13］Friedman SL.Cytokines and fibrogensis.Semin Liver Dis,1999;19:129-140
�。�14］ Border WA,Noble NA.TGF-beta in kidney fibrosis:a target for gene therapy.Kidney Int,1997;5:1388-1396
［15］letal muscle expression of decorin prevents fibrotic disease in rat kidney.Nat Med,1996;2:418-423
�。�16］ Inoue T,Nabeshima K,,Shima Y,Koono M.Hepatocyte growth factor/Scatter factor(HGF/SF)is a regulator of fibronectin splicing in MDCK cells:comparison between the effects of HGF/SF and TGF-beta 1 on fi splicing at the EDA region.Biochem Biophys Res Commun,260:225-231
�。�17］Li D,Friedman SL.Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellate cells:new insights and prospects for therapy.J Gastroenterol hepatol,1999;14:618-633
... |
