|
關(guān)鍵詞： 基因 表達 差異
高等真核生物的基因組一般具有80 000～100 000個基因，而每一個細胞大約只表達其中的15%［1］�；蛟诓煌毎g及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發(fā)育與分化、衰老與死亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細胞周期調(diào)控等。比較細胞間基因表達的差異為我們揭示生命活動的規(guī)律提供了依據(jù)。
由于真核細胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此現(xiàn)有的方法基本上都是利用共同引物將不同的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA為對象研究基因表達的差異。1992年 Liang等［2］建立了一種差異顯示反轉(zhuǎn)錄 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），為檢測成批基因表達的差異開辟了新天地。迄今為止已出現(xiàn)了大量應(yīng)用該技術(shù)的研究報道［3，4］。然而，盡管應(yīng)用 dDRT-PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)［5］；(2)假陽性率可以高達90%［6］；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。近年來，針對 dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測差異表達基因的方法出現(xiàn)，現(xiàn)僅就這方面的進展做一簡要介紹。
1.基因表達指紋（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技術(shù)使用生物素標(biāo)記的引物 bio-T13合成 cDNA第一鏈，用 dGTP對其進行末端加尾，再以富含 c的引物引發(fā)合成 cDNA第二鏈。用限制性內(nèi)切酶消化雙鏈 cDNA，以交聯(lián)有抗生物素蛋白的微球捕獲 cDNA3′端，以 t4DNA連接酶連接同前述內(nèi)切酶相對應(yīng)的適配子，并以 bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進行特異的 pCR擴增，得到大量的特異 cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標(biāo)記后，固定于微球上的 cDNA片段經(jīng)過一系列酶切，產(chǎn)生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標(biāo)記末端的片段經(jīng)凝膠電泳后構(gòu)成 mRNA指紋圖譜。通過分析不同細胞間的指紋圖譜就能得到差異表達的序列［7］。 gEF技術(shù)所需的工作量較 dDRT-PCR明顯減少，由于用酶切反應(yīng)替代了條件不嚴(yán)格的 pCR反應(yīng)，其重復(fù)性也較好，假陽性率低，并且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。 gEF技術(shù)最大的缺點在于電泳技術(shù)的局限。由于它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經(jīng)過幾輪酶切之后常會得到1 000～2 000條電泳帶，而現(xiàn)有的 pAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%～30%的 mRNA能夠被辨認出來，因此得到的只能是高表達基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關(guān)某種細胞的基因表達譜，可能比較困難；采用雙向電泳技術(shù)可能會有所幫助［8］。
2．基因表達系統(tǒng)分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基于兩條理論。首先，一段來自某個轉(zhuǎn)錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有9～10個 bp，就能夠特異地確認該轉(zhuǎn)錄子。第二，對短片段標(biāo)簽的鏈接有利于在同一克隆中對多個標(biāo)簽測序。 sAGE也是用生物素標(biāo)記的 bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈 cDNA，然后以限制酶（錨定酶）進行酶切，捕獲 cDNA3′端。在此處產(chǎn)物被分為兩部分，分別與包含有 iIS型內(nèi)切酶（標(biāo)簽酶）位點的 a、 b連接子相接。 iIS型內(nèi)切酶的特點是作用位點處于識別位點之外。這樣經(jīng)過酶切，就有可能得到只有9～10bp的標(biāo)簽序列。每兩個標(biāo)簽的鈍端結(jié)合后成為 pCR的模板，以基于 a、 b連接子的引物進行 pCR反應(yīng)的結(jié)果是得到了大量每條包含兩個不同來源標(biāo)簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標(biāo)簽鏈接在一起（大約為每條包含數(shù)十個不同來源的標(biāo)簽），克隆至質(zhì)粒載體中后集中測序［9，10］。 sAGE的最終結(jié)果是通過計算機統(tǒng)計得到的，根據(jù)某個標(biāo)簽出現(xiàn)頻率的高低來判斷并計算其所屬基因表達的豐度。對于在數(shù)據(jù)庫中找不到對應(yīng)序列的標(biāo)簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對 cDNA文庫進行篩選，以尋找新基因。 sAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，精確到每個細胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達譜，系統(tǒng)地分析基因表達的差異。它的缺點在于工作量非常大，有大量的測序及計算機分析任務(wù)；而且，對于尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選 cDNA文庫是很不嚴(yán)格的，根據(jù)我們的經(jīng)驗，往往是假陽性結(jié)果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段顯示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用帶有“踵”結(jié)構(gòu)的錨定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一鏈，以 okayama和 berg的置換法合成 cDNA第二鏈，然后將雙鏈 cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由 a1和 a2兩條寡核苷酸構(gòu)成，其序列與所用限制酶識別位點相符合，先將 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就會形成一個 y型結(jié)構(gòu)；把 y型適配子與酶切后的 cDNA片段相連接，以適配子及錨定引物中所含序列為特異引物進行 pCR反應(yīng)，則只有 cDNA3′末端的一段被擴增出來，這時的產(chǎn)物可用凝膠電泳表示出來構(gòu)成差異表達圖譜。對于每次切割6bp的限制酶來說，每種大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有 cDNA都顯示出來［11］。 cDNA3′端 rFD與 gEF的思路比較相似，由于它利用多種限制酶進行酶切，因此不會象 gEF因凝膠電泳分辨率不夠而漏掉信息。它的重復(fù)性較好，假陽性率低，尤其是對于已知基因，可以根據(jù)選擇內(nèi)切酶的作用位點確定該基因在凝膠電泳中的位置并判斷其含量，從而避免了進一步的分析。對于精力有限的研究人員，這可能是個值得一試的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相類似的缺點，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時間對所得到的差異條帶進一步分析。
4.分子指數(shù)的 rNA指紋（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一種能夠較好地顯示 mRNA中編碼序列的方法。它利用Ⅱ s型內(nèi)切酶的作用位點在識別位點之外可以形成一個4bp的突出端的特點，設(shè)計43共64種（最外側(cè)一個核苷酸隨機）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規(guī)方法合成雙鏈 cDNA，用Ⅱ類限制酶進行酶切后連接5′端磷酸化的相應(yīng)適配子，再以Ⅱ s類內(nèi)切酶酶切后形成一個隨機的4 bp突出端，用連接有生物素的64種適配子予以結(jié)合，可將這些限制片段分為64類，用包被抗生物素蛋白的磁珠捕獲連接產(chǎn)物，就可以利用前后兩個適配子所攜帶的特異序列為引物進行 pCR擴增反應(yīng)，凝膠電泳顯示表達差異［12］。由于擴增的序列位于 cDNA內(nèi)部，因此最后得到編碼序列的可能性很大，這是該方法最大的優(yōu)點。鑒于并不是所有 cDNA都含有某一識別位點，故采用不同的內(nèi)切酶組合。理論上可以顯示所有的差異表達基因，但這樣一來工作量就變得十分巨大。因此，該方法只適合對樣本的快速分析和部分差異表達基因的研究；如果要對某種細胞的基因表達進行全面的研究，可能還要采用其它的方法。
5.抑制性消減雜交（ suppression subtractive hybridization， sSH）: SSH方法源于代表性差異分析法（ representational difference analysis, RDA）。它原是一種研究基因組之間差異的以雜交為基礎(chǔ)的方法。 diatchenko等［13］將“抑制性 pCR”理論［14］與 rDA相結(jié)合，建立了一種分離差異表達基因的新方法。 sSH將需要檢測的細胞稱為“檢測子”，將對照細胞 mRNA稱為“驅(qū)趕子”，把 mRNA合成 cDNA后，通過僅僅兩輪雜交和 pCR過程，就能有效地分離到在檢測子中表達，而在驅(qū)趕子中不表達或表達豐度不同的 mRNA（圖5）。通過 sSH有可能得到某種細胞中相對其他組織的差異表達基因的全面信息，它較好地克服了其它方法中低豐度基因難以得到的問題，據(jù)稱對低拷貝基因的富集可以達到1 000～5 000倍，因此可能發(fā)現(xiàn)一些用原有方法沒有檢測到的新基因。這方面已經(jīng)有人進行了嘗試［15，16］，獲得了一些成果。 sSH的不足之處在于它需要 mRNA的量較大，檢測子和驅(qū)趕子都要達到2微克以上，這在某些情況下是非常難以做到的，因此目前有關(guān) sSH的報道基本上都以腫瘤細胞為研究對象。
基因表達差異的研究方法在 dDRT-PCR出現(xiàn)之后又有了很大的發(fā)展，每種方法都各有自己的優(yōu)缺點，研究人員應(yīng)該根據(jù)自己的側(cè)重點選擇適合于自己的方法。目前真正能夠做到簡單、準(zhǔn)確、全面地揭示基因表達差異的方法仍在不斷探索之中，因此許多研究機構(gòu)仍采用 dDRT-PCR來達到自己的目的，畢竟經(jīng)過最近數(shù)年的完善，該技術(shù)在許多方面都有了一定的改進，完成一般的研究項目已是綽綽有余。 sSH作為一種基因表達差異研究的新方法，假陽性率低，所得到的結(jié)果也更加全面，因此，希望以不太復(fù)雜的方法全面揭示差異表達基因的研究者，可以嘗試一下這種方法。
參考文獻
1 fields C, Adams MD, White O, et al. How many genes in the human genome? Nat Genet, 1994,7:345-346.
2 liang P， pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 1992,257:967-971.
3 diachenko LB, Ledesma J, Chenchik AA, et al. Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA. Biochem Biophys Res Comun, 1996, 219: 824-828.
4 adati N, Ito T, Koga C, et al. Differential display analysis of gene expression in developing embryos of Xenopus Laevis. Biochem Biophys Acta,1995,1262:43-51.
5 buess M, Mornol C, Hirsh HH. Direct identification of differentially expressed genes by cycle sequencing and cycle labelling using the differential display PCR primer. Nucleic Acids Res, 1997, 25：2233-2235.
6 sompayac L, Jane S, Burn TC, et al. Overcoming limitations of the mRNA differential display technique. Nucleic Acids Res, 1995,23:4738-4739.
7 ivanova NB， Belyavsky AV. Identification of differentially expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. Nucleic Acids Res, 1995,23:2954-2958.
8 hatada I, Hayashizaki Y, Hirotsune S, et al. A genomic scanning method for higher organisms using restriction sites as landmarks. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88:9523-9527.
9 velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, et al. Serial analysis of gene expression. Science, 1995,270:484-487.
10 velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. Characterization of the yeast transcription. Cell, 1997,88:243-251.
11 prashar Y, Weissman SM. Analysis of differential gene expression by display of 3′ end restriction fragments of cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:659-663.
12 kato K. RNA fingerprinting by molecular indexing. Nucleic Acids Res,1996,24:394-395.
13 diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030.
14 siebert PD, Chenchik A, Kellogg DE, et al. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1087-1088.
15 vonstein OD, Thies WG , Hofmann M. A high throughput screening for rarely trancribed differentially expressed genes. Nucleic Acids Res,1997,25:2598-2602.
16 kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridazation identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell line. Nucleic Acids Res, 1998,26:1116-1123.
... |
