幽門螺桿菌的生物學(xué)特性的研究

　　幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp)與胃炎和胃潰瘍的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。眾所周知，胃炎與潰瘍屬于多發(fā)病、常見病，其病因不明。自從Warren和Marshall于1983年首先從胃炎患者的胃粘膜上皮組織中觀察螺桿菌和分離到Hp，他們認(rèn)為胃炎或潰瘍病的發(fā)生與Hp的感染有密切的關(guān)系。近年來國(guó)外在這方面進(jìn)行了不少研究工作；國(guó)內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)本菌在慢性胃炎及消化性潰瘍的病人中檢出率較高。但有關(guān)Hp的生物學(xué)特性及致病性的研究則很少�，F(xiàn)將我們對(duì)這方面的研究結(jié)果報(bào)告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 各型胃病患者共200例。年齡19歲～80歲，平均46.9歲。男222例，女78例�；颊呓�(jīng)胃鏡檢查時(shí)，均在胃竇部或求部鉗取粘膜組織兩塊，置于含10%滅活小牛血清的布氏肉湯中放于4°C冰箱中保存，送檢。

　　1.2 方法

　　1.2.1 尿素試驗(yàn) 參考Christtensen尿素肉湯培養(yǎng)和mlorris等快速診斷法,先用2%液體尿素常規(guī)法,后用10%液體尿素1min檢查法及5%尿素濾紙片法,進(jìn)行了對(duì)比研究。

　　1.2.2 直接涂片鏡檢 用保存液將胃粘膜研磨成勻漿后，取一滴推成涂片，甲醇固定后用0.3%堿性復(fù)紅單染，于顯微鏡下直接檢查。

　　1.2.3 幽門螺桿菌培養(yǎng) 以布氏瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入6%脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素（TmP5mg/L、萬(wàn)古霉素6mg/L、兩性霉素2mg/L)，制成血平皿，放置4°C冰箱中保存、備用。從送檢的Hp保存液中用白金耳取出胃粘膜組織塊放入玻璃研磨器中，加入0.5ml保存液，研磨成勻漿，用1ml吸管吸取0.2ml于血平皿中涂勻，將平皿置于10%CO2，5%O2及85%N2混合氣體培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)72h后觀察培養(yǎng)結(jié)果。剩下 液體勻漿于尿素酶快診及直接涂片鏡檢。

　　1.2.4 藥敏試驗(yàn) 抗菌藥物敏感試驗(yàn)所用試紙系參考WHO建議的藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)內(nèi)外有關(guān)資料制備而成，由大連生物試劑廠生產(chǎn)，專供用紙片擴(kuò)散法來檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感度。試驗(yàn)中所用菌液為用0.1%胨生理鹽水洗下的37°C48h培養(yǎng)物，濃度為2×109cfu/ml。用1ml吸管取0.1ml菌液于血平皿上，涂勻，之后將藥敏片按適當(dāng)?shù)拈g距平貼于平皿上，一般9m直徑的平皿上貼6張藥敏片。最后將平皿置于混合氣體培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48～72h，觀察試驗(yàn)結(jié)果，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

　　1.2.5 殺螺桿菌抗體檢測(cè) 原理：氧化酶反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)菌，由于氧化酶的作用，可使TTC用滅菌蒸餾水配成0.5%的溶液；指示菌用Hp295 37°C48h的培養(yǎng)物，其濃度為107cfu/ml；補(bǔ)體一指示菌懸液的制備：補(bǔ)體取4只豚鼠的新鮮分離血清，用生理鹽水作1:20稀釋，再加入最終濃度為1%（V/V)的指示菌，即為濃度相當(dāng)于105cfu/ml的補(bǔ)體—指示菌懸液；微量定量板用4×10孔板。方法：①每孔先加入0.1ml生理鹽水。②第一孔加入1:5被檢滅活血清（取自胃病患者)0.1ml，之后順序作從1:10～1:5120的對(duì)倍稀釋。③每孔加補(bǔ)體—指示菌懸浮液一滴，約0.05ml。④最后每孔加入含0.01%TTC布氏肉湯0.1ml（0.5%TTC用布氏肉湯作50倍釋稀�；旌虾笊w上塑料蓋，于37°C培養(yǎng)20～24h后觀察結(jié)果。以無紅色出現(xiàn)的孔內(nèi)的血清稀釋度作為被檢血清的殺螺桿菌抗體的最高滴度。

　　1.2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)選用小鼠C57、BALb/c和金黃色地鼠（由本所動(dòng)物室提供)用布氏肉湯將新培養(yǎng)的Hp菌洗下，濃度大約配成2×109cfu/ml，每只小鼠一次灌胃約0.5～1ml菌液，每周2次，共4次～6次，末次灌胃后3～7d，處死動(dòng)物，解剖后取兩塊胃粘膜組織作尿素酶快診和Hp菌培養(yǎng)及組織切片。

　　1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用X2檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 尿素酶快速診斷 Hp能產(chǎn)生大量的尿素酶，分解尿素產(chǎn)生氨，使pH值升高，據(jù)此將尿素酶液全培養(yǎng)基顏色由桔黃色變?yōu)榉奂t色的反應(yīng)定為陽(yáng)性反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示：

表 1 不同時(shí)間尿素酶快診結(jié)果

　　從表中看出，4h和24h尿素酶快診的陽(yáng)性率分別為55%和62%。在300份胃病患者的胃粘膜Hp培養(yǎng)中，有195例為陽(yáng)性。陽(yáng)性率為65%，與4h尿素酶快診陽(yáng)性率之間無顯著性差異，（P＞0.05)。尿素酶快診陽(yáng)性結(jié)果與Hp培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系良好，培養(yǎng)出的195例Hp菌株作尿素酶快診，在1min內(nèi)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，特異性達(dá)100%。而4h和24h尿素酶快診的敏感性分別為84.6%(165/195)。因此用尿素酶作Hp快診，在早期及Hp培養(yǎng)后進(jìn)行，均有其非常特異而重要的意義。

　　2.2 直接涂片鏡檢 對(duì)其中21例作了直接涂片鏡檢，結(jié)果有4例鏡下可見成簇Hp（+++)占19.0%；有1例鏡下易找到Hp（++)，占4.8%；有9例鏡下可見Hp零星存在（+)，占42.9%；6例鏡檢為陰性。鏡檢陽(yáng)性率為66.7%。21例Hp 培養(yǎng)陽(yáng)性為16份，陽(yáng)性率為76.2%，與鏡檢陽(yáng)性率之間無顯著差異（P＞0.05)。鏡檢陽(yáng)性符合率為87.5%(14/16)。

　　2.3 Hp的運(yùn)送、培養(yǎng)及生化反應(yīng)

　　2.3.1 運(yùn)送 Hp生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件很高，而從采樣到分離培養(yǎng)需要一段時(shí)間，送檢中保存問題當(dāng)然重要，有文獻(xiàn)報(bào)道將胃粘膜標(biāo)本浸在20%葡萄糖液體內(nèi)送檢，5h之內(nèi)不會(huì)影響陽(yáng)性率。為了探索一條保存時(shí)間長(zhǎng)、效果好的方法，我們?cè)囉煤?0%小牛血清的布氏肉湯作標(biāo)本保存液，4°C冰箱保存，用冰壺送檢，隨機(jī)對(duì)300例胃粘膜標(biāo)本進(jìn)行了不同時(shí)間的分離培養(yǎng)，所用平皿是新配制或在密閉條件下保存?zhèn)溆玫�，增養(yǎng)結(jié)果是保存1～8h的標(biāo)本陽(yáng)性率為47.5%～78.6%，有1例標(biāo)本不保存液中存放了17d后Hp培養(yǎng)仍陽(yáng)性。

　　2.3.2 培養(yǎng) 300例胃粘膜標(biāo)本，培養(yǎng)Hp結(jié)果有195份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為65.0%。菌落形態(tài)：37°C微氧條件下培養(yǎng)72h后，可見0.5～1mm直徑大小、圓形、扁平、濕潤(rùn)、半透明的灰白色菌落，偶爾可見菌落周圍有β微溶血現(xiàn)象。菌體形態(tài)：顯微鏡下菌體呈弧型、S型或海鷗展翅狀，與空腸彎曲菌相類似。72h鏡檢菌體呈弧形或彎曲狀，比空腸彎曲菌要大，著色較好。五日以上菌體呈多形狀，有直桿形、微彎曲型或球形，著色不均勻。

　　2.3.3 生化反應(yīng) Hp的氧化酶、過氧化酶、尿素酶均為陽(yáng)性反應(yīng)。其中尿素酶反應(yīng)的時(shí)間與細(xì)菌濃度成反比。葡萄糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、及3.5%NaCl反應(yīng)均為陰性。馬尿酸水解反應(yīng)84.1%為陰性，15.9%為弱陽(yáng)性。1%甘氨酸反應(yīng) 87.0%為陽(yáng)性。0.04%2、3、5TTC反應(yīng)8.6%為陽(yáng)性。

　　2.4 藥敏試驗(yàn) 選取22株生長(zhǎng)良好的Hp菌作藥敏試驗(yàn),結(jié)果如表2所示.從表中可以看出：Hp對(duì)鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、先鋒霉素、利福平、卡那霉素、紅霉素、新霉素及大霉素較為敏感。而對(duì)復(fù)方新諾明、萘啶酮酸和多粘菌素B有耐受作用。另外，選用8株Hp對(duì)中醫(yī)研究院研制的五種中藥即Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ號(hào)及胃丹C進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明作用減弱，抑菌環(huán)直徑分別為16～20mm，20mm，10～20mm，0mm及10～14mm。

表2 22株Hp的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

　　注：( )內(nèi)敏感百分比

　　2.5 殺菌桿菌抗體 對(duì)40份受檢胃病患者的血清進(jìn)行了殺Hp抗體的檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果見表3。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn) ，殺Hp抗體滴度≥1:160時(shí)為陽(yáng)性，則殺Hp抗體檢測(cè)試驗(yàn)的實(shí)際陽(yáng)性率為57.5%。對(duì)應(yīng)40份患者胃粘膜標(biāo)本Hp培養(yǎng)陽(yáng)性者為29份，陽(yáng)性率為72.5%，與殺Hp抗體試驗(yàn)的陽(yáng)性率之間無顯著性差異（P＞0.05)。

　　2.6 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 ①尿素酶快診僅BALb/c小鼠呈陽(yáng)性反應(yīng)，其他小鼠均為陰性。而正常BALb/c小鼠胃粘膜的尿素酶快診也偶爾呈陽(yáng)性反應(yīng)，因此推測(cè)尿素酶陽(yáng)性者不一定是Hp感染，由何引起有待進(jìn)一步研究。②Hp培養(yǎng)均為陰性。③尿素本科陽(yáng)性的BALb/c小鼠的胃粘膜病理組織切片檢查，可見粘膜上皮中有嗜酸性染色的桿菌存在，在大量白細(xì)胞，偶爾可見形態(tài)類似螺桿菌的細(xì)菌的存在。

表3 殺幽門螺桿菌抗體試驗(yàn)結(jié)果

　　3 討論

　　幽門螺桿菌所含脂肪酸種類含量與其它彎曲菌及腸道菌不同。在DNA雜交試驗(yàn)中，其DNA與螺旋菌或弧菌不相溶，而只與螺桿菌的DNA相容。此菌可使人罹患慢性活動(dòng)性胃炎。電鏡觀察該菌表面粗糙，且具有許多單孔有鞘的鞭毛，且鞭毛鞘細(xì)胞壁外膜相連。Hp菌形為弧形、D型或海鷗展翅狀，革蘭染色陰性，堿性復(fù)紅單染效果較好。尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶反應(yīng)性陽(yáng)性。微氧條件下生長(zhǎng)，在血平皿上及含10%小牛血清的布氏肉湯中生長(zhǎng)良好。195份Hp培養(yǎng)陽(yáng)性的胃粘膜標(biāo)本中，4h尿素酶快診的陽(yáng)性檢出率為84.6%，特異性為100%。直接涂片鏡檢能查出較為典型的Hp菌，陽(yáng)性檢出率為87.5%。因此，這兩種方法對(duì)于Hp菌的快診都具有重要的意義。為了配合臨床的診斷粘膜標(biāo)本應(yīng)盡快送檢。但如送檢條件受限，標(biāo)本可保存在含10%小牛血清的布氏肉湯液體保護(hù)中。在4°C冰箱中，Hp一般可存活1W左右，最長(zhǎng)者可存活17d。更好的保護(hù)液有待進(jìn)一步研究。由于Hp的存活、傳代保存問題尚未解決，致使各實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)不盡一致的結(jié)果，所以需要有一個(gè)適合于Hp菌生長(zhǎng)的統(tǒng)一的陽(yáng)性對(duì)照，如培養(yǎng)基中加入血清、活性炭、玉米淀粉、豬胃粘蛋白、甲基纖維素的mlueller-hinton瓊脂、布氏瓊脂、胰酶消化大豆瓊脂等等，以適合于Hp生長(zhǎng)、吸收或抑制毒性因子。

　　目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)Hp的研究尚處初期階段，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Hp與慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍有關(guān)，用敏感的抗生素及TDB治療，隨著病變的恢復(fù)，Hp消失，潰瘍的復(fù)發(fā)率也隨之降低。除應(yīng)用一些敏感的抗生素之外，中草藥的研究、治療也不可忽視。

　　對(duì)Hp動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，國(guó)外報(bào)道用無菌動(dòng)物及悉生動(dòng)物（SPF)，主要有幼年小豬、水獺、雪貂及恒河猴等。國(guó)內(nèi)探索用大白鼠研究胃炎及潰瘍的動(dòng)物模型，觀察Hp感染組與非感染組的不同藥物療效。我們實(shí)驗(yàn)室用不同種的小白鼠進(jìn)行Hp感染，沒能形成明顯的病理改變，推測(cè)其原因可能是受試動(dòng)物對(duì)Hp不敏感而形成自身保護(hù)，Hp菌不能長(zhǎng)期滯留胃內(nèi)，對(duì)胃粘膜不能構(gòu)成威脅。因此，為了研究Hp的毒力，致病性，為了研制一種療效高、副作用小的中、西藥物，一種適宜的動(dòng)物模型是非常重要的。

陳晶晶1 莊弢1 蔣秀高1 甘毓麟2 齊強(qiáng)2 李文東2

1中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所微生物學(xué)研究所（北京 102206)

2北京積水潭醫(yī)院（北京 100035)

*本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目