免疫細胞化學技術在研究和診斷自身免疫性疾病中的應用

　　十、胃壁細胞抗體（Gastric parietal cell antibodies, PCA)的檢測

　　Taylor等（1962)和Iruine等（1962)同一年發(fā)現(xiàn)PCA，以惡性貧血病人血清中陽性率最高（90%～100%)。慢性萎縮性胃炎國外報告陽性率20%～60%，伴有惡性貧血者可達90%。其次，甲狀腺疾病，糖尿病、腎上腺皮質(zhì)機能減退及缺鐵性貧血等疾病，常伴有PCA陽性。我國惡性貧血發(fā)病率低，PCA陽性率在15%～25%之間，正常人2%～5%，60歲以上可高些（16%)。Strickland等（1973)稱PCA陽性萎縮性胃炎為A型胃炎，胃竇炎的發(fā)病率低，大部分為胃體廣泛性萎縮病變，發(fā)展后果為惡性貧血。B型患者PCA陰性，胃竇炎的發(fā)病率高，胃體部僅有局限性萎縮病變。各種疾病PCA檢出陽性率見表15-7。

表15-7 各種疾病PCA檢出陽性率

　　Odger等（1968)發(fā)現(xiàn)惡性貧血病人胃粘膜內(nèi)含IgA細胞減少到正常的10%，IgM細胞減至50%，而IgG細胞則增加至15%，后者選擇性的出現(xiàn)在殘余的壁細胞周圍。Baur等（1968)用人胃粘膜勻漿中微粒體部分標記熒光素和9例惡性貧血病人胃粘膜切片反應，其中7例PCA陽性者的胃粘膜因有層見特異性吸附熒光的漿細胞，證實PCA是炎性浸潤的漿細胞所產(chǎn)生。

　　十一、胃泌素細胞抗體（Gastrin Cell antibodies, GCA)的檢測

　　慢性表淺性胃炎病人有33%血清中GCA陽性，慢性萎縮性胃炎病人也有32%陽性。提示慢性表淺性胃炎與慢性萎縮性胃炎可能是相同本質(zhì)的病變，可能有著共同的自身免疫反應的背景和發(fā)病基礎。

　　GCA的檢查方法，殺死雄性小白鼠后立即取胃竇組織，固定于4%MFF液中3天（MFF液的配法：在60^℃的蒸餾水25ml中加入4g多聚甲醛，加4滴1N NaOH，再用NaOH或Na₂HPO₄調(diào)ph 至7.4后，再加入0.1mol/l PB Ph7.4 25ml)。組織脫水后，用56^℃石蠟包埋，切片3～5μm。56^℃烤干，脫蠟至水洗，取病人血清滴加在切片上，37℃45min，用常規(guī)間接免疫熒光法染色。熒光顯微鏡觀察，可見G細胞漿呈黃綠色熒光，即是GCA陽性。

　　十二、胰島細胞抗體（Islet cell antibady, ICAb)的檢測

　　Bottazzzo（1974)用人胰腺，近年有人用兔胰腺的冰凍或石蠟切片抗原，間接免疫熒光法檢測糖尿病人血清中有ICAb，發(fā)現(xiàn)約在60%～70%的新診斷的胰島素依賴型糖尿�。↖DDM)病人不論年齡大小，其ICAb均呈陽性。ICAb對胰島四種細胞均起反應，一般是暫時性的。只有約20%或更少的ICAb陽性者可持續(xù)2～5年。而單純飲食控制的非胰島素依賴型糖尿病陽性率很低，和對照組相似（約0.05%)。在IDDM病人中，有85%的糖尿病人于癥狀發(fā)作后，立即出現(xiàn)ICAb，并隨病程的持續(xù)而減少。Leudrum等（1976)報告用間接免疫熒光細胞化學發(fā)現(xiàn)ICAb在依賴胰島素的糖尿病人中陽性率為38%（319/829)。而非依賴胰島素的糖尿病人中陽性率只有1.7%（3/177)是ICAb陽性。

　　ICAb是針對胰島細胞細胞質(zhì)成份的抗體，或許是在癥狀發(fā)生之前，緊接著細胞損害而出現(xiàn)的。提示IDDM的發(fā)病可能具有自身免疫反應的免疫病理機理。

　　十三、抗腎小球和肺泡基底膜抗體的檢測

　　免疫病理證明基底膜抗體是引起肺出血腎綜合征即Goodpasture symdrome的主要病因。需要取病人的痛和肺穿刺活檢組織，作冰凍切片，用直接免疫熒光細胞化學方法檢測Igg ，IgM和C₃等在基底膜上沉著的情況。在腎小球和肺組織基底膜上呈線形熒光分布。在人急性腎小球腎炎中可見呈線形熒光，而膜性腎小球腎炎中，抗原抗體復合物沿腎小球基底膜呈結節(jié)　狀沉積，藉以診斷和鑒別診斷。

　　1．抗原切片　　取病人腎穿刺或肺穿刺組織，作冰凍切片，厚4～6μm，不固定。腎切片應先在顯微鏡下選取有腎小球的用作免疫熒光染色。

　　2．直接法免疫熒光細胞化學染色方法分別用抗人IgG、IgA、IgM和補體C₃熒光抗體染色。同時作對照試驗。

　　3．熒光顯微鏡檢查肺出血腎綜合征病人的肺泡基底膜，腎小球基底膜上都呈現(xiàn)明亮的線形熒光。主要是IgG類抗體，補體C₃熒光也呈線形，沿基底膜線形彌散分布。

　　十四、抗皮膚成分自身抗體的檢測

　　抗皮膚成分的自身抗體在皰疹性皮膚病中具有診斷和鑒別診斷意義，尋常性天皰瘡具有鱗狀上皮細胞間隙抗體，類天皰瘡具有基底膜帶抗體。這種自身抗體無種屬特異性。用直接免疫熒光法檢測皮膚活檢組織，間接法可用以檢測病人血清中的抗皮膚成分抗體。

　　1．抗原切片直接法免疫熒光細胞化學檢查，可以取病人皮膚活檢組織作冰凍切片。

　　間接法檢查常用大白鼠，豚鼠的食道上1/3部分作冰凍切片。也有人曾用猴、人、小白鼠和兔的食道上皮組織，人的正常皮膚，大白鼠、猴、豚鼠和兔唇和舌等作冰凍切片。認為人正常皮膚，小白鼠食道和大白鼠舌，可作為常用抗原，材料來源方便，經(jīng)濟，易推廣應用。

　　2．免疫熒光細胞化學染色方法

　�。�1)直接法：取病人皮膚活檢組織一部分作常規(guī)石蠟切片，HE染色，作常規(guī)病理組織學診斷，一部分作冰凍切片的直接法免疫熒光染色。熒光抗體用抗人IgG、IgA、IgM和補體C₃分別染切片。同時作對照試驗。

　�。�2)間接法：用病人血清與食道等抗原切片反應后，分別用抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體染色陽性結果，可以進一步作滴度檢測。同時作對照試驗。

　　3．熒光顯微鏡檢查直接法檢測結果可見皰疹性皮膚病中各有一定的熒光形態(tài)，可見免疫球蛋白的沉積。

　　劉榮卿等（1987)用直接免疫熒光組織化學方法，對臨床擬診為天皰瘡或大皰性類天皰瘡病例進行檢查，活檢取病變附“正�！逼つw標本，用羊抗人IgG、IgM、IgA及C₃熒光抗體染色，結果可見天皰瘡9例中，取自“正常”組織標本均見表皮細胞間有IgG沉積，1例并有IgM、IgA，2例有C₃，7例毛囊上皮和（或)汗腺上皮細胞間有IgG、IgM、IgA、C₃沉積。用間接免疫熒光檢測8例均陽性，大皰性類天皰瘡8例中，取自“正�！逼つw標本均陽性，主要為基底膜出現(xiàn)IgG（7例)，C₃（8例)，1例為IgM，1例伴有IgA。天皰瘡及大皰性類天皰瘡均為自身免疫性疾病，皮膚及血液中分別存在抗表皮細胞表面抗體、天皰瘡抗體及抗基底膜抗體-類天皰瘡抗體，這些自身抗體結合在皮膚、粘膜的相應部位。

　　不同皰瘡性皮膚病的間接熒光圖形如表15-8

　　表15-8 皮膚抗體陽性熒光分布

　�。–linical Immunology P146, 1971)

　　十五、唾液腺外分泌導管上皮自身抗體的檢測

　　在診斷Sjogren’s綜合征時檢測唾液腺外分泌導管上皮細胞抗體具有重要意義，陽性率達65%，用人或猴唾液腺組織（O型)不固定的冰凍切片，間接免疫熒光細胞化學法檢測，可見導管上皮細胞漿呈黃綠色熒光。

　　十六、抗橫紋肌自身抗體的檢測

　　抗橫紋肌自身抗體出現(xiàn)在50%以上的肌無力癥和胸腺瘤病人，正常人未發(fā)現(xiàn)。屬IgG類抗體，用間接免疫熒光法檢測此抗體，準確簡便。

　　1．抗原切片取人或大白鼠骨骼肌，沿肌纖維平行方向作冰凍切片，不固定。

　　2．間接法免疫熒光染色方法染色的方法步驟與其他自身抗體間接法相同，但在熒光抗體染色之后，要延長PBS洗滌時間，3次PBS洗滌，每次30min。封裱切片。

　　3．熒光顯微鏡檢查可見橫紋肌A-帶呈陽性熒光，無例外的都是胸腺腫瘤病人。單純肌無力病人主要與I帶和H帶呈現(xiàn)陽性熒光有關。某些肌無力病人血清只含與“白纖維反應抗體，另一些只含有與”紅纖維反應的抗體，呈斑點狀熒光。橫紋肌抗體和胸腺髓細胞、心肌呈一定程度的交叉反應。當血清稀釋至1：60時，可獲得更清晰的橫紋熒光圖像。

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