免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在研究和診斷自身免疫性疾病中的應(yīng)用

　　五、抗著絲點(diǎn)抗體的檢測方法

　　1．HEP-2細(xì)胞涂片的制備HEP-2細(xì)胞系人喉癌上皮細(xì)胞，在完全Eagle培養(yǎng)液中，37^℃，二氧化碳孵育48～72h，使細(xì)胞生長達(dá)到一定數(shù)量，約1.2～1.5×10⁶/ml，經(jīng)胰酶消化后，可以傳代或分裝到置有玻片的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)用Eagle液培養(yǎng)及上述條件孵育，48h細(xì)胞不僅貼附于玻片上并已長成單細(xì)胞層。取出玻片用丙酮固定15min，自然干燥后待用，或保存于-20^℃或4℃中。

表15-3 各種抗核抗體及臨床意義

　　注：Sm（Smith)；RNP：核糖核蛋白；Sn：為小核；SSB：干燥綜合征B；SS-A：干燥綜合征-A，Scl-70：硬皮病70，抗原分子量70000；PCNA：增殖細(xì)胞抗原；PM-1：多發(fā)性肌炎-；RANA：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)　核抗原；dsDNA：雙鏈DNA；ssDNA：單鏈DNA。

　　2．染色方法用間接免疫熒光法。

　　3．結(jié)果著絲點(diǎn)抗原是緊附于染色體著絲點(diǎn)的DNA蛋白質(zhì)，當(dāng)與相應(yīng)抗體結(jié)合后熒光圖型為約46個(gè)圓的熒光亮點(diǎn)。國際上多用HEP-2細(xì)胞，因這種細(xì)胞核大，分裂相旺盛，著絲點(diǎn)容易顯露，這種抗體在進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥（PSS)中陽性率可達(dá)31%～98%，是PSS的CREST型的標(biāo)記抗體，CRESF是指具有軟組織鈣化，雷諾現(xiàn)象，食管功能低下，指端硬化，毛細(xì)血管擴(kuò)張的PSS患者。

　　六、抗甲狀腺自身抗體（Thyroid Autoantiodies)的檢測方法

　　Roitt等（1956)和Witebsby等（1957)就發(fā)現(xiàn)橋本氏病人血清中有對甲狀腺提取的抗體活性，后來White（1957)首次用間接免疫熒光染色方法研究橋本氏病人血清存在對甲狀腺膠質(zhì)（thyroid colloid)的抗體獲得成功。此后，Landing等（1958)和Holbrow等（1959)以不固定的甲狀腺切片作抗原。檢查出慢性甲狀腺炎（Chronie thyroiditis)病人血清中有和細(xì)胞漿結(jié)合而呈現(xiàn)明亮染色的抗體。Blizzard等（1960),Doniach 等（1960)發(fā)現(xiàn)第二膠質(zhì)抗體，血高γ球蛋白，沉淀素陰性，鞣酸細(xì)胞血凝試驗(yàn)陰性，抗甲狀腺微粒體補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。Balfoour等（1961)用免疫熒光法研究一些甲狀腺病人時(shí)總結(jié)指出：甲狀腺膠質(zhì)抗體有三種不同的熒光形態(tài)：一種是呈三維狀云絮狀，是一種血清沉淀素陽性產(chǎn)生的抗甲狀腺球蛋白抗體。另一種是膠質(zhì)部分熒光呈裂紋形，膠質(zhì)無明顯陽性熒光，而膠質(zhì)邊緣和裂紋處呈明亮熒光，鞣酸化細(xì)胞血凝反應(yīng)陽性，沉淀素反應(yīng)陰性。第三種即上述的膠質(zhì)呈均勻熒光形狀，證實(shí)這是一種稱第二膠質(zhì)的抗體。近30多年的研究證明免疫熒光方法檢查甲狀腺自身抗體是一個(gè)特異、敏感、簡便的方法，對于臨床診斷和治療，隨訪和預(yù)后，甲狀腺某些疾病的自身免疫性質(zhì)的發(fā)病機(jī)理研究等，都有一定的實(shí)用價(jià)值。我們20年大量研究結(jié)果也證明確實(shí)如此。用免疫熒光法檢查甲狀腺自身抗體已成為許多國家中，診斷甲狀腺疾病的常規(guī)檢查項(xiàng)目之一。

　　檢查這種抗體的免疫熒光方法要求取正常人的甲狀腺或手術(shù)摘出的甲狀腺組織，用冰凍節(jié)　片（3～6μm)用作甲狀腺球蛋白抗體檢查切片需要經(jīng)56^℃純甲醇固定3min；用作甲狀腺微粒體抗原切片無需固定處理，因固定會破壞微粒體的抗原性。按常規(guī)間接方法進(jìn)行。

　　關(guān)于甲狀腺抗體的研究已報(bào)告有甲狀腺球蛋白抗體，微粒體抗體，第二膠質(zhì)抗體，甲狀腺刺激免疫球蛋白抗體，甲狀腺激素T₄及T₃抗體，細(xì)胞表面的促甲狀腺激素受體的抗體等。

表15-4 不同甲狀腺疾病甲狀腺自身抗體的陽性率（%)

　　七、平滑肌抗體（Smooth muscle antibody , SMA)的檢測

　　Johnson（1965)首次用免疫熒光組織化學(xué)間接法在狼瘡樣肝炎病人血清中發(fā)現(xiàn)了SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whitingham用病人自身平滑肌作抗原，證實(shí)了SMA的自身免疫性。狼瘡性肝炎或慢性活動性肝炎病人血清中SMA的陽性率可達(dá)80%以上。Donidht和Whitehouse先后報(bào)告了急生病毒性肝炎病人血清中SMA為IgM，而慢性活動性肝炎病人血清中SMA在發(fā)病初期（1～4期)為IgM，而后為IgG。Anderson利用純化肌漿蛋白為抗原與肝炎病人血清中分離的IgM和IgM類SMA進(jìn)行吸收試驗(yàn)，證明了SMA的特異性。Holborrow Gamel和Renbe先后觀察了SMA與鼠肝細(xì)胞，腎小球及人的甲狀腺上皮細(xì)胞和血小板等組織為抗原的免疫熒光染色結(jié)果，證明這些組織的抗原性均與平滑肌肌動蛋白有著共同性抗原。

　　現(xiàn)在多以大白鼠胃壁和腎組織血管壁平滑肌的4～6μm冰凍切片和抗原，附貼在干凈的蓋玻片上，電扇吹干，放入4^℃干燥劑中保存，用前可固定于95%（4^℃)酒精中1min，或不固定進(jìn)行間接免疫熒光檢測。

　　染色結(jié)果可見胃壁平滑肌，粘膜肌層和肌絲，小血管壁平滑肌等呈現(xiàn)出明亮的黃綠色熒光。有人用熒光檢查急性期甲、乙二型肝炎暫時(shí)出現(xiàn)SMA的陽性率達(dá)80%，稀釋血清應(yīng)在1：10以上的確定為陽性，一般認(rèn)為，肝細(xì)胞表面存在肌動蛋白樣物質(zhì)。慢性活動肝炎患者滴度在1：80以上，急性肝炎患者SMA屬IgM類，滴度1：25以上，慢性遷延性肝炎患者SMA也常陽性，滴度1：25左右。使用皮質(zhì)激素者SMA轉(zhuǎn)陰或滴度降低。健康輸血員用原血清或1：5稀釋，常有9%～18%的低滴度SMA陽性，似無診斷意義，SMA與性別，年齡無關(guān)。

　　非肝病的SMA陽性者，主要見于傳染性單核細(xì)胞增生癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)　炎，支原體感染疣，惡性腫瘤（如乳腺癌)。除傳染性單核癥滴度可達(dá)1：320外，一般�！�1:25，其血清與非肌性結(jié)構(gòu)細(xì)胞不產(chǎn)生反應(yīng)。

　　平滑肌抗體是抗肌球蛋白和肌纖維收縮蛋白的抗體，當(dāng)肝細(xì)胞損害時(shí)，釋放抗原引起的自身免疫反應(yīng)。已證實(shí)慢性活動性肝炎病人血清中平滑肌抗體是具有特異性的血清學(xué)標(biāo)志，但必須是高效價(jià)（1：80)以上，因在人群中常見低效價(jià)（1：10～1：20)。臨床的研究指出，平滑肌抗體與生化指標(biāo)改變程度相關(guān)，說明高效介平滑肌抗體與肝臟損害有關(guān)。Kurki等研究SMA在慢性活動性肝炎等的意義。

　　Middelton等報(bào)告檢查了70例腎衰病人自身抗體，腎移植后3個(gè)月平滑肌抗體IgM類陽性率占76%，而移植前14%。SLE常是SMA呈陰性結(jié)果，可作鑒別診斷參考。

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