二、應(yīng)用ISHH技術(shù)對染色體制片、基因分配（Chromosomal assignment of genes)的研究
（一)基本原理
染色體上基因位置分配的研究，又叫染色體圖的研究，包括基因名稱、基因在染色體的位置及與相鄰基因的距離及其核酸序列的研究。研究基因圖的方法包括家系的連鎖分析法、體細(xì)胞雜交法、重組DNA技術(shù)和原位雜交法。果蠅的線形基因圖和大腸桿菌、T4噬菌體兩者的環(huán)狀基因圖都已繪成，目前正致力于人類基因圖的繪制。人類基因約有5萬～10萬個，根據(jù)第八次國際人類基因定位工作會議，已定位的人類基因總數(shù)達(dá)1479個。
ISHH技術(shù)對染色體基因圖的研究，是用同位素或生物素、地高辛標(biāo)記的核酸探針，直接同中期的染色體鋪片行雜交。早期的研究是用于重復(fù)序列DNA的定位，如編碼核糖體的基因18S和28S核糖體RNA定位于第13～15號染色體和第21～22號染色體短臂次縊痕區(qū)。5S核糖體RNA定位于第1號染色體上長臂的遠(yuǎn)側(cè)Iq42～I(xiàn)q43。近年已能進(jìn)行單拷貝基因的定位，如胰島素基因定位于IIp 15上、C-mos原癌基因定位于Sq22上、N-ras原癌基因定位于IPI34。在染色體11的短臂上，利用ISHH技術(shù)證明4個基因依次排列，從短臂的遠(yuǎn)端依次為胰島素、β-球蛋白、HRASI和PTH。
�。ǘ�)操作步驟（Bhatt and MCGee, 1990)
在前面已介紹了制備血培養(yǎng)染色體鋪片的方法。下面介紹的是在染色體制片上用免疫金銀染色法進(jìn)行原位雜交的基因定位顯示、結(jié)合Giemsa染色顯帶技術(shù)的操作步驟。
1．移除內(nèi)源性RNA
（1)加100μl RNA酶溶液，覆以蓋玻片，放在有少許2×SSC溶液的濕盒內(nèi)孵育，37℃，60min。
�。�2)在2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，以2×SSC洗2×3min。
�。�3)等級酒精系列脫水，10%，50%，70%，90%和100%，各1min，各1min�？諝飧稍�。
2．探針標(biāo)記和純化用缺口平移法將生物素11-dUTP標(biāo)記在DNA核酸探針上。
3．變性與雜交
加20～100ng生物素標(biāo)記探針到雜交液中，加入5μl 20mg/ml人或鯡魚精子DNA，總?cè)萘繛?0～40μl，離心5s，混勻后，滴于染色體鋪片，覆以蓋玻片，蓋片四周以橡皮泥封固。放入盛2×SSC溶液溫盒內(nèi)75℃7～8min，使之變性，繼之于37℃孵育16h。
4．雜交后漂洗2×SSC溶液內(nèi)移除蓋玻片，將載片浸入含50%甲酰胺的2×SSC溶液內(nèi)，pH7.2,20min,42℃。然后作下列程序漂洗
溶液 漂洗時間 溫度
2×SSc 20min 42℃
1×SSC 20min 室溫
0.1×SSc 20min 室溫
5．免疫細(xì)胞化學(xué)顯示
�。�1)孵育載片于PBt 15min，將片緣及背面擦干，加100μl一抗于載片（兔抗生物素抗血清1：100，以PBT稀釋)，孵育于37℃40～60min。
�。�2)快速用PBT沖洗，擦干片緣及背面，加100μl二抗抗血清（羊抗兔IgG結(jié)合10～20nm金粒，以PBT1：50稀釋)于載片染色體鋪片部位，37℃孵育45～60min。
�。�3)PBS洗3×5min。
�。�4)蒸餾水洗3×5min。
�。�5)加數(shù)滴銀溶液于載片上，在光鏡下監(jiān)測，大約需5～18min可見在染色體上出現(xiàn)銀斑點。
�。�6)蒸餾水洗。PBT配制見附錄3。
6．顯帶復(fù)制（Replication banding)
（1)應(yīng)用5μg/ml Hoechst 33258在2×SSC溶液內(nèi)，暗室中染載片20min。
（2)蒸餾水洗，以2×SSC封固，覆以蓋玻片，蓋片四周封以橡皮泥。
�。�3)紫外光照射1～16h。
�。�4)蒸餾水洗和以10%Giemsa（磷酸緩沖液稀釋，pH6.8～7.2)染色10min。
�。�5)蒸餾水沖洗，空氣干燥，以DPX封固。
（6)光鏡下觀察，可見棕色的銀斑點在染色體上的定位，并顯示其與染色體分帶的關(guān)系。
