一、質(zhì)粒DNA的提取及鑒定
�。ㄒ�)質(zhì)粒DNA的提取及鑒定
1．收獲細(xì)菌
�。�1)將2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到通氣良好的15ml的試管中，接入一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。
�。�2)將1.5ml培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，用臺式離心機于4℃以12000g離心5min，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
�。�3)吸盡培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。
2．堿裂解法小量抽提質(zhì)粒
�。�1)將細(xì)菌沉淀[上述步驟（3)所得]重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中，劇烈振蕩。
�。�2)加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS)，緩和振蕩，水浴5min。
�。�3)加150μl預(yù)冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，緩和振蕩，冰浴5min。
�。�4)4℃以12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
�。�5)可作不可作：加等量飽和酚，氯仿，振蕩混勻，重復(fù)2，（4)。
�。�6)用2倍體積無水乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合，于室溫放置2min。
（7)4℃以12000g離心5min。
（8)小心吸盡上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，再將附于管壁的液滴除盡。
（9)用75%乙醇于4℃洗滌DNA，同上離心去上清真空抽干。
�。�10)加50μl的1×TE（含20μg/ml無DNA酶的胰RNA酶)，振蕩，貯存于-20℃。
�。ǘ�)質(zhì)粒DNA的大量制備
�。�1)同上1.（1)
�。�2)將1ml含菌液倒入含相應(yīng)抗生素的Lb 100ml中，37℃振蕩培養(yǎng)至A590=1.0(5～6h)。
�。�3)加氯霉素（170μg/ml)擴增，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。
（4)收集菌液于離心管中，冰浴10min。3000rpm,離心10min，去上清。
（5)加溶液Ⅰ5ml懸浮菌體，將懸液倒入高速離心管中，搖勻，冰浴5min。
（6)加溶液Ⅱ10ml輕輕混勻，室溫下5min。
�。�7)加溶液Ⅲ7.5ml輕輕混勻，冰浴30min。15000rpm，4℃離心20min。
�。�8)取上清液于高速離心管中，加2倍體積的無水乙醇，混勻，入-20℃3～5h。
（9)15000rpm 4℃ 離心20min。
�。�10)棄上清，將離心管倒放入真空泵中抽干（10～15min)。
�。�11)用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于過夜。
（12)加入5ml飽和酚，混勻，4000～5000rpm離心5min，取上清液入5ml離心管內(nèi)。
（13)分別加入2.5ml飽和酚，2.5ml氯仿，混勻后同樣離心收集上清。
�。�14)加等體積氯仿/異戊醇（24：1)混勻，同樣離心收集上清。
（15)加入1/10體積的3mol/l NaAc及2倍體積的無水乙醇于-20℃3～5h。
�。�16)10000rpm 4℃離心20min。
（17)棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。
�。�18)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解質(zhì)粒DNA。
�。ㄈ�)質(zhì)粒DNA的鑒定
1．酶切反應(yīng)
�。�1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混勻，37℃水浴1h以上。
�。�2)取反應(yīng)物點樣，觀察酶切效果。
�。�3)酶切完全后，70℃5min終止反應(yīng)。
2．瓊脂糖電泳
（1)配制所需濃度瓊脂糖凝膠。
（2)在待測的DNA樣品中加1/5體積的溴酚藍指示劑，混勻后點樣。
�。�3)打開電源開關(guān)，5V/cm電泳。醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站www.med126.com
（4)在UV燈下觀察電泳結(jié)果。
二、DNA的重組
�。ㄒ�)DNA的酶切與連接
�。�1)酶切反應(yīng)
同質(zhì)粒DNA的鑒定，只不過是質(zhì)粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。
�。�2)加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。
（3)15000rpm離心15min，棄上清。
（4)加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。
�。�5)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。
�。�6)測定DNA的含量。
（7)加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應(yīng)12～16h。
�。�8)連接反應(yīng)液可置-20℃保存，供轉(zhuǎn)化用。
（9)關(guān)于待插入DNA片段的獲得參見附注。
