�。ǘ�)試劑盒成份
1．無標(biāo)記對(duì)照DNA1 此管內(nèi)有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分別用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它們的混合比例為2：3：3，共有16個(gè)Pbr328片段，這些片段的大小分別為：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。
2．無標(biāo)記對(duì)照DNA2 此管內(nèi)有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ線性化。
3．DNA稀釋緩沖液 有兩管，每管1ml[成分為：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]內(nèi)含鮭魚精DNA（50μg/ml)。
4．標(biāo)記對(duì)照DNA 此管內(nèi)有50μl線性化pBR328DNA，按標(biāo)記方法已標(biāo)記有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的標(biāo)記DNA。
5．六聚核苷酸混合物
6．標(biāo)記用混合底物 此管內(nèi)有50μl 10倍濃度的dNTP標(biāo)記用混合底物，含dATP（1mmol/L)dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。
7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（標(biāo)記級(jí)) 此管內(nèi)有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow)，2U/μl。
8．（Dig)AP結(jié)合物 此管內(nèi)有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，結(jié)合有堿性磷酸酶750U/ml。
9．NBT 有兩管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V)二甲基甲酰胺的硝基藍(lán)四唑鹽溶液（75mg/ml)。
10．X-磷酸鹽 有兩管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml)。
11．封阻試劑 有兩瓶，每瓶有50g粉劑。
�。ㄈ�)需配制的溶液
EDTA（0.2mol/L),pH8.0 (20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽；10%（V/V)SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L檸檬酸三鈉；pH7.0 Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris –HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。
�。ㄋ�)操作方法
1．標(biāo)記DNA探針 每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3μg線性的DNA，也可標(biāo)記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。
�。�1)DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。
（2)取Eppendorf管（1.5ml)置于冰上，加下列及試劑：
新鮮變性的DNA 1-3μg
六聚核苷酸混合物 2μl（管5)
dNTP標(biāo)記用混合底物 2μl（管6)
加無菌重蒸水至 19μl
DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow) 1μl（管7)
（3)在37℃保溫至少60min，可到20h。
（4)煮沸5min，終止反應(yīng)。
�。�5)15000rpm離心30s，置于冰上待用。
2．預(yù)雜交 按100cm2膜用20～40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。
預(yù)雜交液組成：5×SSC
0.5%（W/V)封阻試劑（管11)
0.1%（W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉
0.02%（W/V)SDS
膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過夜。
3．雜交 按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋，使里面的溶液重新分配。
雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V)
5%（W/V)封阻試劑
5×SSC
0.1（W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉
0．02%(W/V)SDS
新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml)
雜交液取代預(yù)雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h)。
4．洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。
（1)在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V)SDS溶液漂洗，5min，2次。
�。�2)在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
�。�3)在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。
5．免疫測(cè)定
（1)配制溶液
緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)
緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。
緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9)和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10)。
2． 顯色過程
A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min)。
B．在100ml緩沖2中保溫30min。
C．再用緩沖液1短暫洗滌。
D.用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。
E.膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。
F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。
G.膜在緩沖液3中平衡2min。
H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯影時(shí)，不可振蕩或攪拌。
I．當(dāng)要求的點(diǎn)或帶已被檢測(cè)時(shí)，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。
J．?dāng)z相。
說明：上述各反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行，除了顯色反應(yīng)外，均需振蕩或攪拌。
