�。ǘ�)組織DNA的制備
�。�1)將200mg組織在冰浴條件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB緩沖液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml帶蓋的塑料管中。
（2)加SDS至濃度為1%（可加0.4ml10%SDS)，混勻。由于DNA從核中釋放出來，樣品變得粘稠。
�。�3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl，終濃度為100μl/ml，37℃保溫1～3d，直到組織完全解體。中間可振動(dòng)樣品管幾次。加0.4ml 5mol/L NaCl。
�。�4)用等體積飽和酚、1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿-異戊醇及等體積氯仿-異戊醇（24：1)各抽提一次，3000rpm離心5min，用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相。
�。�5)加2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纖維絲狀的大片段DNA，并移入一新管，吸干DNA中的無水乙醇。
�。�6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中，4℃過夜可作進(jìn)一步純化。
�。�7)加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保溫5h。加0.4ml 5mol/L NaCl。
�。�8)同上法用飽和酚、氯仿-異戊醇抽提，乙醇沉淀離心，棄上清。
�。�9)75%乙醇洗滌2次，離心，棄上清，真空抽干。適量1×TE溶解，保存在4℃。
六、轉(zhuǎn)移基因
最常用的將克隆重組的DNA片段導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法是用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的DNA可能是通過吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)行細(xì)胞核。
�。�1)配制下列溶液
①2×HEPES-緩沖鹽溶液（HBS)
�、�2mol/L CaCl2
�、�0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存于4℃。
�、蹹NA：將DNA（約20μg/106細(xì)胞)溶于0.1×TE（pH8.0)，使用濃度為40μg/ml。為使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，質(zhì)粒DNA應(yīng)用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應(yīng)加入載體DNA將DNA濃度調(diào)至40μg/ml。實(shí)驗(yàn)室制備的真核載體DNA轉(zhuǎn)染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應(yīng)通過乙醇沉淀或氯仿抽提進(jìn)行滅菌。
（2)轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶進(jìn)行消化以獲得對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以1～2×105細(xì)胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養(yǎng)皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h。
�。�3)每轉(zhuǎn)染一個(gè)60mm培養(yǎng)皿中的單層細(xì)胞，須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物：取步驟一所制備的DNA[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣（溫和混合30s左右)。于室溫育20～30min，其間將形成細(xì)小沉淀。溫育結(jié)束時(shí)，用吸管將混合液吹打一次，使沉淀物懸浮。
通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣（250mmol/L)的DNA。按照前述方法溫育之。
如果需要轉(zhuǎn)染更為大量的細(xì)胞，上述兩種反應(yīng)混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養(yǎng)液中，而在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，一般將1ml沉淀物加入10ml培養(yǎng)液中。
已經(jīng)發(fā)表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認(rèn)為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟(jì)于事，并建議用電動(dòng)移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規(guī)勸在加入DNA溶液時(shí)連續(xù)而緩慢地混勻，然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物，以致降低轉(zhuǎn)化效率。實(shí)際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大小（讓高分子量DNA從細(xì)針頭中通過，可將之剪切變小)、緩沖液的精確pH（有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液，逐批試驗(yàn)沉淀物的質(zhì)量及轉(zhuǎn)染效率)。如果必須使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，就要花時(shí)間針對(duì)特定的系統(tǒng)優(yōu)化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗(yàn)的試劑，只需依照前面方法進(jìn)行配制和貯存，即可在長期內(nèi)獲得可重復(fù)的結(jié)果。
（4)將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞單層上的培養(yǎng)液中[在60mm培養(yǎng)皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養(yǎng)液中]，輕輕左右晃動(dòng)一下培養(yǎng)皿使培養(yǎng)液得以混合，此時(shí)可見培養(yǎng)液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養(yǎng)液，直接把沉淀物加到細(xì)胞上，將細(xì)胞置于室溫溫育15min，然后再將培養(yǎng)液加回到培養(yǎng)皿中，此時(shí)細(xì)胞上有許多細(xì)小顆粒。采用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)長達(dá)24h[時(shí)間的長短取決于后續(xù)處理步驟的不同，見步驟（5)]。
（5)然后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可依以下任一種方法處理：
�、偃绻贿M(jìn)行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后)，可在細(xì)胞培養(yǎng)16～24h后，吸出培養(yǎng)液和沉淀物，用PBS將單層細(xì)胞再洗一次。然后按下述③d操作。
�、谠谠S多情況下，同時(shí)用氯喹處理細(xì)胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對(duì)DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時(shí)間不能超越細(xì)胞對(duì)其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來決定適于所用特定型別細(xì)胞的最佳氯喹濃度。但對(duì)于大部分型別的細(xì)胞，用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3～5h，都可取得良好效果�？稍诹姿徕}-DNA共沉淀物加入細(xì)胞之前或之后（見步驟（4)介紹的其它方法)，直接將氯喹二磷酸貯存液（過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中，100mmol/L)稀釋（1：100)于培養(yǎng)液中。在氯喹處理過程中，細(xì)胞呈現(xiàn)泡狀是正常的。經(jīng)用DNA和氯喹處理3～5h后，棄去培養(yǎng)液和沉淀，用PBS洗，然后按下述d操作。
�、塾酶视投虝禾幚砑�(xì)胞，同樣可提高轉(zhuǎn)化效率或?qū)隓NA的瞬時(shí)表達(dá)水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進(jìn)行。由于不同細(xì)胞對(duì)甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊，因此每種型別的細(xì)胞都必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)決定最佳處理時(shí)間（從30s至3min)。耐受甘油的細(xì)胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物（含或不含氯喹)的生長液3～5h后進(jìn)行休克。
a. 吸出生長液，用PBS將單層細(xì)胞洗1次；
b.在單層細(xì)胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油，在37℃培養(yǎng)0.5～3min；
c.吸出甘油，用PBS將單層細(xì)胞洗1次；
d.加入5ml預(yù)加溫的完全生長液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～60h后，檢測DNA的瞬時(shí)表達(dá)或?qū)⒓?xì)胞重新種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中，分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
�、軜I(yè)以表明，丁酸鈉也可以在猴源和人源細(xì)胞中增強(qiáng)帶SV40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的重組質(zhì)粒的表達(dá)�？芍苯釉谏L液中加入有關(guān)試劑，也可以使經(jīng)過甘油休克的細(xì)胞接受丁酸鈉處理。須視細(xì)胞型別的不同，采用不同濃度的丁酸鈉（500mmol/L貯存液，在化學(xué)通風(fēng)櫥中用NaOH中和丁酸制備而成)，例如：
CV-1 10mmol/L
NIH-3T3 7mmol/L
HelaS3 5mmol/L
CHO 2mmol/L
不加完全生長液，然后重復(fù)步驟d。
�。�6)轉(zhuǎn)移基因表達(dá)和細(xì)胞集落形成
①瞬時(shí)表達(dá)：在轉(zhuǎn)染后48～60h收獲細(xì)胞，進(jìn)行RNA或DNA雜交分析。新合成的蛋白質(zhì)可以用放射免疫測定Western印跡，體內(nèi)代謝標(biāo)記－免疫沉淀或者細(xì)胞提取液中酶活性的測定等方法來進(jìn)行分析，如果測定中有重復(fù)品或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞要經(jīng)過多種不同條件或在一段時(shí)間歷程以內(nèi)取不同時(shí)間進(jìn)行處理，就要避免皿與培養(yǎng)皿之間轉(zhuǎn)染效率的偏差。在這些情況下，最好轉(zhuǎn)染大片的單層細(xì)胞（90mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)24h后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，再分接到若干較小的培養(yǎng)皿上。
�、诜�(wěn)定轉(zhuǎn)化：在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24h，使所轉(zhuǎn)移基因得到表達(dá)之后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基在2～3周內(nèi)每2～4d須更換1次，以便除去死細(xì)胞殘骸并使抗性細(xì)胞集落得以生長。
可以克隆單個(gè)細(xì)胞集落，增殖后進(jìn)行測定�？梢杂帽A(yù)冷的甲醇將仍保留在培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞固定15min，再于室溫用10%Giemsa染色15min，最后用自來水沖洗，這樣即可得到細(xì)胞集落數(shù)的永久記錄。Giemsa染液可用PBS或水現(xiàn)用現(xiàn)配，并用Whatman 1號(hào)濾紙過濾。
重新接種細(xì)胞以便取得分隔良好的細(xì)胞集落所要求稀釋倍數(shù)，主要由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率來決定。這一效率可以相差若干個(gè)數(shù)量級(jí)，它起決于：a.受體細(xì)胞的型別（即使同一細(xì)胞系，克隆不同或傳代數(shù)不同，也表現(xiàn)出顯著差異)；b.導(dǎo)入基因的特性及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)強(qiáng)弱；c.轉(zhuǎn)染中所用供體DNA的量。
