�。ㄎ�)排除實驗中問題的方法
1．DNA不能有效地被標(biāo)記時考慮
�。�1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。
�。�2)標(biāo)記反應(yīng)的保溫時間延長（增至20h)。
�。�3)DNA變性或許不完全，這時對大片段DNA特別重要。
2．不能達到預(yù)期的靈敏度時考慮
（1)DNA標(biāo)記率。
（2)增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時間。
�。�3)顯色反應(yīng)的時間可延長至3d。
3．若顯色時背景過深，可采取
�。�1)在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。
�。�2)增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。
（3)某些類型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。
（4)在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。
四、核酸的分子雜交
核酸分子的固相雜交是將待測核酸樣品結(jié)合在某種固相支持物上，然后與溶液中的標(biāo)記探針進行雜交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纖維膜。這里重點介紹直接點樣技術(shù)，轉(zhuǎn)移技術(shù)及其它常用的雜交技術(shù)。
（一)斑點雜交的直接點樣法
斑點雜交或叫打點雜交（dot-blot hybridization)，其主要特點是事先不用限制內(nèi)切酶消化或用凝膠電泳分離核酸樣品，操作簡便，靈敏度高。一個點樣品只含0.25～1pg的DNA也能檢測到。但不知道雜交片段的大小（堿基對數(shù))。
1．DNA的打點法（DNa Dot Blot)
（1)膜的處理：戴上干凈手套，取出硝酸纖維膜，按需要剪成一定大小，量好各樣點間距離，用軟鉛筆標(biāo)記。
�。�2)DNA變性：將DNA溶液于1×TE（pH8.0)緩沖液中或蒸餾水中，取一定量DNA樣品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。
�。�3)點樣：用塑料或硅化玻璃或微量加樣器取1～5μl變性DNA，將滴管放在硝酸纖維膜上，使DNA慢慢吸在濾膜上，點樣完后涼干。
�。�4)固定：將涼干的濾膜夾在濾紙中，于80℃干烤2～3h，然后進行雜交。
2．RNA的打點法（RNa Dot Blot)
�。�1)膜的處理：同DNA的打點法。
�。�2)RNA變性：將提取的RNA與50μl 20×SSC/甲醛（30μl 20×SSC加20μl甲醛)混合，65℃水浴15min。
�。�3)點樣：同DNA的打點法。
�。�4)固定：同DNA的打點法。
（二)DNA的吸印轉(zhuǎn)移法（Southern Blot)
DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化和凝膠電泳后，放入堿性溶液中使其變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠中按原來位置和順序用濾紙吸印轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后再與標(biāo)記探針雜交。此方法比較準(zhǔn)確地保持了特異DNA序列在電泳圖譜中的位置，而且能測定分子量。
試劑：變性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液：1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaCl pH8.0
20×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉，3mol/l NaCl
1．電泳 取DNA約5μg加限制性內(nèi)切酶進行酶切，電泳鑒定酶切完全后，取酶消化后的DNA點樣于0.8%～1.2%的凝膠上，以0.8～1V/cm電壓電泳過夜，在溴酚藍離凝膠前緣0.5cm處停止電泳。將電泳后的凝膠翻轉(zhuǎn)，紫外燈照射10～20min后拍照。
2．變性與中和 將電泳后的凝膠放入變性液中25℃振蕩60min。蒸餾水洗膠1min，將凝膠放入中和液中25℃振蕩60min。
3．轉(zhuǎn)移 取托盤一只，放入10×SSC溶液約500～1000ml，托盤上搭一塊比凝膠稍寬的長方形玻璃，取一長方形Wateman paper（濾紙)搭在橋上，兩邊浸入10×SSC溶液中，仔細去掉玻璃與濾紙之間的氣泡（用玻棒在濾紙上滾動)。將凝膠放在濾紙上，去掉凝膠與濾紙之間的氣泡。將硝酸纖維膜放入2×SSC溶液中浸濕后放在凝膠上（如NC膜浸濕不均勻，則考慮更換NC膜，操作時手切勿觸及NC膜)，去掉凝膠與NC膜之間的氣泡。將一張濾紙（長和寬均比NC膜小1mm)放在NC膜上，仔細去掉氣泡。將吸水紙切成與濾紙大小，重疊放在濾紙上，再壓一重物約500～1000g。轉(zhuǎn)膜24h，中間更換吸水紙。
圖23-7 Southern轉(zhuǎn)膜示意圖
4．固定 用2×SSC溶液洗膜5min去掉殘余凝膠，讓膜自然涼干。將凝膠放入EB液中30min，取出在UV燈下觀察是否有DNA殘余。80℃烤膜2h，然后將膜封入塑料袋進行雜交。
