藥學的生物化學-學術講座:現代生物技術與生物藥物

現代生物技術與生物藥物

中國藥科大學  姚文兵

內 容 摘 要

21世紀，人類將迎來生物經濟的時代，生命科學的飛速發(fā)展，已使以化學為主體的傳統(tǒng)藥學研究模式迅速向以生命科學與化學相結合的新型模式轉變發(fā)分子生物學為代表的現代生物技術的研究與完成雖然只有短短幾十年的時間，卻對藥學學科從新藥發(fā)現、藥物研究、藥物生產、藥物質量控制好藥品，臨床應用等方面均產生了重要的影響，同時，以現代生物技術手段生產的干擾素、白細胞介素、紅細胞生成素為代表的數十種生物技術藥物在臨床的成功應用，使醫(yī)藥生物技術成為生物技術領域發(fā)展最快，效益最高，最具發(fā)展前景的一個應用領域；全球生物工程和新醫(yī)藥產業(yè)，伴隨著生命科學的突飛猛進，始終保持著良好的發(fā)展勢頭，并在全球經濟中占有越來越重要的位置。因此，及時反映生物技術的原理、技術、方法在制藥領域的應用，順應國際生物醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展趨勢，使藥學及相關專業(yè)，包括執(zhí)業(yè)藥師等能及時了解生物技術制藥的最新發(fā)展動態(tài)是十分必要的。

第一章  現代生物技術的內涵

一、生物技術的定義

以電子信息技術、新藥源技術、航天技術、生物技術、新材料技術等為代表的高技術是20世紀人類科學技術事業(yè)最偉大的成就。生物技術，英文為Biotechnology，有時也被人們稱為生物工程（Bioengineering)，這可能強調這一領域源發(fā)于生命科學與工程技術的結合。但是由于在國際上應用Biotechnology這一術語遠較Bionengineering普遍，所以在我國生物技術這個名稱似乎更為通用。

那么什么是生物技術，究竟如何定度它，在這一點上，國內外的學者曾下過多種大同小異的定義，綜合這些定義，我們可以這樣來理解它：

“生物技術就是利用生物有機體（這些生物有機體包括從微生物至高等動、植物)或其組成部分（包括器官、組織、細胞或細胞器等)發(fā)展新產品或新工藝的一種技術體系�！�

一般認為，生物技術包括四個方面：

（1)基因工程：主要涉及一切生物類型所共有的遺傳物質——核酸的分離、提取、體外剪切、拼接重組以及擴增與表達等技術。

（2)細胞工程：包括一切生物類型的基本單位——細胞（有時也包括器官或組織)的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合發(fā)及細胞核、細胞質及至染色體與細胞器（如線粒體、葉綠體等)的移值與改建等操作技術。

（3)酶工程：指的是利用生物機體內酶所具有的特異催化功能，借助固定化技術，生物反應器和生物傳染器等新技術、新裝置、高效優(yōu)質地生產特定產品的一種技術。

（4)發(fā)酵工程：也有人稱為微生物工程，就是給微生物提供最適宜的發(fā)酵條件生產特定產品的一種技術。

生物技術的這四大組成部分雖然均可以自成體系，構成獨立的完整技術，但在許多情況下又是高度相互滲透和密切相關的，事實上如果沒有這種相互滲透和彼此依賴生物技術也就不可能成為高新技術，因為生物技術的依據和出發(fā)點是生物有機體本身的種種機能，是各類生物在生長、發(fā)育與繁殖過程中進行物質合成、降解和轉化的能力（也就是利用其新陳代謝的能力)，各種生物，不管是低等的細菌、真菌等微生物，還是高等的動物、植物、人，其新陳代謝的過程就好像是一座反應器，而且是效率極高的反應器，在此反應器中，各種各樣代謝反應（化學反應)在各種生物催化劑——酶的催化下有條不紊地進行，而什么酶催化什么反應，該酶具有什么樣的特異結構與功能，又是受特定的遺傳基因所決定，所以從某種意義上說，基因工程和細胞工程可看做是生物技術的核心基礎，因為通過基因工程和細胞工程可以創(chuàng)造出許許多多具有特殊功能或多種功能的“工程菌株”或“工程細胞株”，這些“工程菌株”或“工程細胞株”往往可發(fā)使酶工程或發(fā)酵工程生產出更多、更好的產品，發(fā)揮出更大的經濟效益，而酶工程和發(fā)酵工程往往又是生物技術產業(yè)化，特別是發(fā)展大規(guī)模生產的最關鍵環(huán)節(jié)，因此，生物技術所包括的四個方面應當是一個完整的整體。

2．20世紀生物學的成就回顧

生物學在20世紀取得了巨大進展。數理科學廣泛而廣泛而又深刻地滲入生物學的結果，全面改變了生物學的面貌，開辟了在分子水平研究生命現象的新學科——分子生物學。分子生物學的研究，涉及生命現象最本質的內容，它把在各層次的生命活動有機地聯系起來，在新的高度上揭示生命的奧秘，從而全面地改變了生物學的面貌，推動了生物學的發(fā)展，并成為現代生命科學的“共同語言”。細胞生物學、神經生物學和結構生物學研究，均己進入了分子水平，成為生物學領域內新的主要生長點。生物分類學和生物進化的研究也因分享了分子生物學的最新研究成果而煥發(fā)了青春。

分子生物學把生命現象中的物質形態(tài)還原為分子，把分子進一步還原為亞分子、結構域（domain)、結構域單元（motif)和原子團；把功能還原為“結構”，把現象還原為調控；把“效應”與“信號轉導”相聯系等等。分子生物學的還原認識論促進了現代生物科學的發(fā)展，提高了人們對生命現象和過程的整體綜合認識水平，成為當代生命科學基礎研究的發(fā)展，提高了人們對生命現象和過程的整體綜合認識水平，成為當代生命科學基礎研究的前提，開辟了現代生物學的全新局面。在實際應用中，它又使生物學以空前主動的態(tài)勢對人類的物質生產品和社會生活產生重大影響。1973年重組DNA獲得成功，誕生了基因工程學，以此為基礎，生物高新技術及其產品的生產正在成為前途遠大的高技術產業(yè)，動物克隆技術生物學信息產業(yè)的興起，更是舉世矚目。生物工程必將在21世紀成為現代化的大工業(yè)，并極大的推動醫(yī)藥學和農業(yè)科學的發(fā)展，在這些領域中現代生物學的發(fā)展正在展示出的廣闊應用前景，必將又一次引起人類社會和經濟生活的革命。

3．現代生物化學的重要發(fā)展領域

（1)結構分子生物學

當今生命科學研究的特征是對分子、細胞、組織、器官及至整體水平的多方位綜合研究。生命活動是核酸、蛋白質等大分子的運動形式，以研究生物大分子的結構、功能為對象的結構分子生物學已成為生命科學的基礎學科之一。結構分子生物學是研究各種生物大分子的結構從簡單結構（一級結構)到復雜結構（空間結構及分子相互作用結構)，都是體現生物信息的“語言”，把這些結構信息“語言”轉換成計算機語言，人們就可應用計算機來貯存生物信息，分辨生物信息，提取生物信息，并對任何感興趣的生物大分子的結構、功能及結構與功能的關系進行分析、預測和比較研究。由此生長點出發(fā)，誕生了“生物信息學”（bioinfomatics)或計算機生物學（computational biology)，由于研究生物大分子結構的新技術、新方法和新儀器不斷改進和涌現，如DNA重組技術、基因合成和測序技術、X-射線衍射分析技術、核磁共振技術、酶逐步降解技術、計算機技術以及不同技術的組合應用等，使獲得高分辨率的結構圖像，了解生命過程中蛋白質構象的動態(tài)變化以及對大分子結構的貯存、比較和結構一功能預測成為可能。現在，生物大分子的三維結構的數據庫迅速擴大，以蛋白質結構數據庫為例，每天都有幾個新的結構增加進來。已闡明了許多具有重要生物學意義和難度較高的生物大分子的結構，如胰島素、天花粉蛋白、人的組織相容性抗原、生長激素與受體復合物、人和動物的一些致病病毒顆粒、HIV蛋白蛋白酶、CD4糖蛋白、細胞器、細胞膜復合物、核糖體等。這些結果表明，已有的技術手段，不僅能搞清楚單純的生物大分子的三維結構，從而把微觀形態(tài)與解剖形態(tài)聯系起來，把大分子與細胞和亞細胞結構聯系起來；進而對生物大分子在生命活動過程中的空間結構的連續(xù)變化進行動態(tài)觀察和分析研究，如已能在毫秒級水平測定酶-底物作用時的構象變化，蛋白質變性和新生肽折疊時的構象變化以及分子伴娘識別多肽和幫助多肽折疊時的構象變化。

結構分子生物學的研究對于研究發(fā)病機制與設計診斷、治療和預防方案具有重要意度，特別對新藥的分子設計與模擬，具有重要指導作用，它已成為合理藥物設計（rationa drug design)的理論基礎。

（2)基因組學

“人類基因組計劃”（human genome project, HGP)，于1990年正式出臺，其主要目標是繪制遺傳連鎖圖、物理圖、序列圖和轉錄圖。經過國際合作，上述目標原來預計在2003年前完成�，F已完成遺傳連鎖圖和物理圖，人類基因組工作草圖也已在2000年6月23日宣布繪制完畢，標示著對人類遺傳密碼“基因組”全部堿基對的解讀已基本告一段落，昭示了人類對自身的了解進入了一個新階段。另外，還完成了細菌、古細菌、支原體和酵母等共17種低等生物的全基因組的序列測定，并逐步擴展到各種模式生物基因組、經濟運動和作物基因組等的研究，這些將是21世紀生命科學領域中的研究熱點�！盎�因組學”（genomics)主要是解決人類基因組的“結構”，在這一目標越來越趨過完成時，人們又提出“后基因組學”（postgenomics)，其實質是將人類基因組研究的重心逐步由“結構”向“功能”轉移。即有關基因組功能信息的攝取、鑒定和開發(fā)利用，以及與相關的數據資料、基因材料和技術手段的貯存和使用。所以“后基因組學”的主要研究內容包括人類基因的識別和鑒定以及基因功能信息的提取和鑒定；在過去幾年里，國際上一批知名的大型制藥集團和化學公司已在基因組研究領域投入巨資，并形成了一個新的產業(yè)部門，即生命科學工業(yè)。制藥工業(yè)就是生命科學工業(yè)的主要支柱，與基因組研究尤其關系密切。藥物基因組學（pharmacogenomics)研究表明，藥物的療效與患者的基因型相關。因此，今后的藥物生產須考慮藥物投放地區(qū)人群中有關的等位基因的頻率，醫(yī)療處方也將因人而異，并趨向個性化。比較基因組學的研究，則有助于從模式生物的資料找到與疾病可能相關的基因，并以此為靶來設計藥物，這就表明現代生物化學發(fā)展的另一個重要特點是基礎研究與應用研究的密切結合。醫(yī)藥學和農學的發(fā)展不斷地向生物化學和分子生物學提取挑戰(zhàn)，隨著基因工程、蛋白質工程、細胞工程和胚胎組織工程的發(fā)展，人類在戰(zhàn)勝各種傳染病、冠心病、艾滋病、腫瘤、計劃生育和抗衰老等方面一定會取得更為有效的手段。當前生物化學的基礎研究成果到實現產業(yè)化的時間距離已大大縮短，如某些細胞因子從基因的發(fā)現到生物工程產品的開發(fā)，只需要1～2年時間，這就有力地證明生物化學基礎研究與現代藥學科學的發(fā)展具有密切關系和巨大應用潛力。

（3)蛋白質組學

研究代謝反應與生理機能的關系是機能生物化學的核心內容，對蛋白質的研究現已從翻譯加工過程的作用機制這一極轉向研究蛋白質降解機制的另一極。在“后基因組”時代出現的一個新領域就是蛋白質組學（proteomics)。蛋白質組學是研究細胞內全部蛋白質的組成及其活動規(guī)律的新興學科。由于mRNA儲存和翻譯調控后加工等的存在，并不能直接反應蛋白質的表達水平；蛋白質自身特有的活動規(guī)律，如蛋白質的修飾加工、轉運定位、結構形成、代謝轉化、蛋白質與蛋白質及其他生物大分子的相互作用等，均無法從基因組水平上的研究獲知，因此，對生物功能的主要體現者或執(zhí)行者——蛋白質的表達模式和功能模式的研究就成為生物化學發(fā)展的必然。

蛋白質組是指基因組表達的所有相應的蛋白質，也可以說是指細胞或組織或機體全部蛋白質的存在及其活動方式。蛋白質組學是從整體的蛋白質水平上，在一個更加深入、更加貼近生命本質的層次上去探討和發(fā)現生命活動的規(guī)律和重要生理、病理現象的本質等，蛋白質組具有多樣性和可變性。蛋白質的種類和數量及其功能狀態(tài)在同一機體的不同細胞中是各不相同的，即使是同一種細胞，它在不同時期、在不同條件下，其蛋白質組也是在不斷的改變之中。此外，在病理狀態(tài)下或治療過程中，細胞蛋白質的組成及其變化，與正常生理過程的也不同。隨著蛋白質組學的誕生，人類就有可能從生物大分子整體活動的角度來認識生命，進而在分子水平上，從動態(tài)的整體的角度對生命現象的本質及其活動規(guī)律和重大疾病的機制進行研究。蛋白質組學的研究內容是蛋白質的表達模式與蛋白質的功能模式。

蛋白質的表達模式主要解決各種細胞或組織的所有蛋白質的表征問題。目前是通過二維凝膠電泳（2DGE)建立一種細胞或組織的蛋白質組二維圖譜，通過計算機模式識別分析各蛋白質的等電點和分子量參數及蛋白質點強度、面積等。再結合以質譜分析為主要手段的蛋白質鑒定及數據庫檢索，從而大量鑒定其蛋白質組成員，形成相應的蛋白質組數據庫。建立機體或組織或細胞的正常生理條件下的數據庫是進行大規(guī)模蛋白質組分析研究的基礎。蛋白質組分析的第二步是比較分析在不同條件下蛋白質組的變化，如蛋白質表達量的變化、翻譯后的加工修飾等；或進一步分析蛋白質在亞細胞水平上的定位的改變等，從而發(fā)現和鑒定出特定功能的蛋白質（群)。

蛋白質組功能模式的研究主要是揭示蛋白質相互作用的連鎖關系和蛋白質發(fā)揮功能所依賴的結構基礎，并為了解大量涌現出的新基因的功能提供依據。蛋白質組學不斷的深入發(fā)展，將在揭示諸如生長、發(fā)育和代謝調控等方面取得突破，并為探討發(fā)病機制、疾病診斷與防治和新藥開發(fā)提供重要的理論基礎。例如可以應用蛋白質組技術發(fā)現藥物作用的新靶點和研究藥物代謝酶譜的變化以及藥物產生毒副作用的相關蛋白質因子，從而為發(fā)現新藥、研究藥物作用機制以及指導臨床合理用藥提供可靠的理論依據。

  （4)神經生物化學

神經生物化學可能是現代生化發(fā)展的最大熱門，因為神經系統(tǒng)不僅是生命活動的中樞，而且與學習、記憶、語言等生命活動直接相關，可能是生命活動中最復雜、最精細的內容。人腦是神經系統(tǒng)最高的組織形式，是最復雜的器官，是一切精神活動的物質基礎。分子生物學的概念與技術已滲透到神經生物學的多個分支，并與其他實驗技術相結合，推動神經生物學的全面發(fā)展，近10年來，神經生化的研究已取得了驚人的進展。

a．突觸傳遞和膜興奮分子元件的結構和功能  根據結構，受體可分為三類，包括遞質（配體)門控性分子通道、G蛋白偶合受體和催化性受體，這三類受體的結構都已通過重組DNA技術克隆闡明，受體的克隆為尋找新的高選擇性的藥物提供了機會。大量的細胞外信號需要通過G蛋白轉導為細胞內效應，已知G蛋白可以直接影響離子通道。根據 G蛋白的。亞基結構，G蛋白可分為Gs、Gi、Go、Gq、G?和Gt六類。遞質轉運蛋白又使釋放的神經遞質回到末梢或攝取到膠質細胞，許多遞質轉運蛋白也被克隆，如GABA轉運蛋白和囊泡膜的單胺類轉運蛋白等。與遞質釋放的某些有關分子，已有多種獲得純化，如Synapsins，VAMP（Synaptobrevin)、Synaptopyhsin， Synaptotagmin， RAB-3、Syntaxin等以及囊泡遞質轉運蛋白。電壓門控性離子通道研究較多的有鈉通道、鈣通道和鉀通道，而首先被克隆的是鈉通道。

b．神經系統(tǒng)發(fā)育研究已發(fā)現，決定成為神經元的基因有Proneural基因（賦與細胞有發(fā)育成神經元的潛能)，Neurogeni基因（選擇成神經元)和Selector基因（決定成為那一種類型的神經元)。一旦細胞被決定發(fā)育成為神經之后，需要一些物質使它分化為成熟并繼續(xù)存在，這種物質稱為神經營養(yǎng)因子，如神經生長因子（NGF)。神經元之間建立聯系要依賴許多分子暗號（molecular cues)，神經元軸突的生長錐（growth cone)有識別分子暗號的受體，在不同時間和空間先后表達，以建立神經之間相互聯系的分子機制。

c．重組DNA和神經系統(tǒng)疾病 應用基因治療技術在帕金森癥方面已取得進展，神經營養(yǎng)物質，如NGF已能用重組DNA技術生產，多種神經系統(tǒng)遺傳性疾病和退化性疾病的基因已被克隆，它們的基因治療已被提上日程。

二、生物技術的優(yōu)越性

生物技術自問世以來就向世人展示它可以多方面應用并可發(fā)展成相應的產業(yè)，因而  很快受到農業(yè)界、醫(yī)藥衛(wèi)生界、化學與食品工業(yè)界以及環(huán)境保護界等各行各業(yè)的極大興  趣和高度重視，原因是生物技術具有以下的優(yōu)越性。

 （一)不可取代性

生物技術能完成一般常規(guī)技術所不能完成的任務，能生產出其他方法所無法生產或  難以生產的產品。

例如：某種植物的品種改良一般采用的是雜交育種，目的在于提高產量，增加抵抗力等，但是常規(guī)的雜交育種一般只限于物種內部，如小麥與小麥，最多只能擴展到親緣關系較近的種屬，因為常規(guī)改良育種，能重組到良種基因中的遺傳資源是受到限制的，但是，用基因工程改良品種，基因資源的來源就可能不受這種限制，如將細菌中的一種毒素轉人煙草和馬鈴薯中，則這種煙草和馬鈴薯就不會受害蟲的危害。又如西紅柿去掉腐爛基因，常溫幾周不壞，把�；蜇i的生長激素基因轉移給魚，使魚的生長、發(fā)育加快，體重迅速增長，把人的血紅蛋白的基因轉移到豬體內，則使豬可以生產人的血紅蛋白，分離這種血紅蛋白可以作為人血液的替代物等等。而在醫(yī)藥行業(yè)，這樣的例子就更多，很多人體內的生長代謝必需的物質由于其含量極微，是很難通過分離、提取或合成的方式生產的，如：生長激素釋放抑制因子，這是一種人腦激素，它的正常作用是抑制生長激素不合時宜的分泌，所以是一種很有用的藥物，有一種病叫做“肢端肥大癥”患者臉形增大、面貌粗陋、手足厚大、生長激素釋放抑制因子就是治療肢端肥大癥的特效藥�？墒且�得到生長激素釋放抑制因子相當不容易，人類第一次分離得到它是1793年，經過了21次的努力，用了50萬個羊腦，得到了5mg樣品，后來也用化學法合成，但5mg價格仍在300多美元。基因工程方法成功以后， 7.5升大腸桿菌發(fā)酵就可得5mg，成本僅幾十美分，類似這樣的例子十分多。

（二)快速、精確

用生物技術生產的試劑盒可以快速、精確地對人類和動、植物疾病進行有效的早期診斷，這對疾病的預防和及時治療十分重要（尤其是遺傳病、病毒引起的疾病和癌癥等嚴重影響人類健康的疾病)，例如用單克隆抗體檢查婦女妊娠比用抗血清法檢查進一步提高了靈敏度，使婦女能在懷孕后8天即得知，準確率可達100％，無疑這一方面對計劃生育是非常有用的，這種妊娠檢查可以避免在不知妊娠情況下服用對胎兒有害的許多藥物，從而保證了胎兒的早期健康發(fā)育，對實現優(yōu)生優(yōu)育也具有特別重要意義。

（三)低耗、高效

用生物技術對化學工業(yè)和制藥工業(yè)進行技術改造具有能耗低，效率高和不依賴特定原料等優(yōu)點，例如用生物催化劑“酶”催化化學效應，不像用化學催化劑那樣需要高溫、高壓和強酸堿等苛刻的條件，這樣就大大降低了能耗的成本，通過生物技術降低成本和能耗的例子，在有機酸和氨基酸的生產中已很明顯：

例如L-蘋果酸生產（生物技術)

這樣生產的L-蘋果酸其成本要比化學合成降低幾十倍。

又如：治療侏儒病的人生長激素，過去只能從死人的腦垂體提取，一個侏儒患者每年所需的用藥量大約要從50個死人的腦垂體中提取，價格十分昂貴且來源十分困難，而用基因工程生產人生長激素價格只有提取的1/4，更為關鍵的是不需要依賴死人腦這樣緊缺的原料來源。

（四)副產物少、副作用小、安全性好

眾所周知，制藥行業(yè)（特別是化學合成藥)也是一種高污染產業(yè)，廢氣、廢水和一些副產物有時都有毒性，又如疫苗的生產，常規(guī)方法就是用血液，這不僅成本高，同時也有可能帶來病毒感染的危險性。事實上，在國內外已出現了很多這方面感染的例子，而通過生物技術，用大腸桿菌來生產這些藥物，如乙肝疫苗，凝血因子等，就大大改進了使用這些藥物時的安全性。

由于生物技術新產品、新工藝的上述優(yōu)越性，許多國家特別是發(fā)達國家都竟相開展生物技術的研究和發(fā)展生物技術產業(yè)，特別是一些著名的跨國公司，如美國的杜邦、孟山都；英國的帝國化學公司；日本的三井、三菱、住友、武田制藥、味之素；德國拜耳；荷蘭的殼牌化學公司；瑞士的西巴-嘉基等。目前國際上能夠排得上名次的生物技術公司已達數千家，我國1987年初開始實馳的“高新技術研究發(fā)展計劃綱要”（863計劃)中，生物技術被列為7領域的重點之一。但是也有幾點需要明確的是，生物技術也像其他高技術一樣是一種知識密集形和資金密集型技術，需要高強度，一次性財力人力和物力投入，這對我國的許多企業(yè)來說還是有較大因難的，必須引起步夠的重視。

三、生物技術在醫(yī)藥領域的應用

（一)基因工程藥品

在后面的章節(jié)將對基因工程藥品有專門敘述。

（二)生物技術在疾病診斷與治療中的應用

1．單克隆抗體與疾病診斷。妊娠試驗所經歷的變革足以說明單克隆抗體的應用對醫(yī)學產生的巨大影響。類似這樣能有效提高診斷水平的單克隆抗體已得到迅速發(fā)展。美國食品與藥物管理局批準上市的單克隆抗體產品已有幾十種。

2．“生物導彈”。用藥物治療腫瘤的難題在于使用的藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷正常分裂的細胞，毒副作用嚴重。于是人們設想，如能制備抗某種腫瘤的單克隆抗體，再在其上接上抗癌藥物，進入體內，讓該單克隆抗體只與該腫瘤細胞特異性結合，豈不就能像導彈那樣把抗癌藥物專一地、靶向地帶到腫瘤細胞而不影響其他細胞？這就是“生物導彈”。但是，按現行制備單克隆抗體的技術路線，所得單克隆抗體是小鼠的免疫球蛋白，對人體來說是異種蛋白，進入人體后易遭排斥而不能有效地到達“靶點”。國外有人用蛋白質工程構建雜合抗體，使作為“生物導彈”的單克隆抗體免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段，明顯地提高了效果。

3．基因診斷�；�因診斷是1978年由簡悅威等在鐮狀細胞貧血癥的研究中突破的。他們采用的是核酸分子雜交的方法。運用同樣的方法，已經有一大批重要的遺傳病，如苯丙酮尿癥、珠蛋白合成障礙性貧血、假肥大型肌營養(yǎng)不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊腎、慢性進行性舞蹈病等，建立了產前基因診斷和癥狀前基因診斷的方法。將核酸分子雜交技術應用于傳染病病原體的檢測，方法更為簡單。80年代中期以來，基因診斷技術又廣泛應用了聚合酶鏈反應體外擴增基因的方法。就生物技術而言，聚合酶鏈反應已成為最有用的技術之一。

4．基因治療。基因治療的最初目標是一些因單一結構基因即編碼蛋白質的基因缺陷所引起的遺傳病，因此，其治療方式就是通過導入正�；�因來校正缺陷基引起的DNA代謝異常以及細胞突變，從而使之恢復正常功能。世界上第一位受益于結構基因藥物治療的是一位叫Ashanti的美國女孩。1990年9月14日，4歲Ashanti成為美國政府批準的基因治療第一人。

（三)未來醫(yī)藥衛(wèi)生領域中的生物技術展望

1．轉基因動物生產的“轉基因藥物”。用轉基因動物生產人用醫(yī)藥制品是基因工程制藥業(yè)中新崛起的最富有誘人前景的行業(yè)。1978年科學家們把人tPA基因轉入小鼠受精卵發(fā)育成轉基因小鼠并證明在其乳汁中能得到tPA以來，美國和英國已組建4家生物技術公司專門從事用轉基因動物生產“轉基因藥物”，并各具特色，如美國DNX公司的“制藥工廠”用轉基因豬，環(huán)球基因藥物公司用轉基因奶牛，基因酶公司用轉基因山羊，英國藥物蛋白公司則用轉基因綿羊。用轉基因動物生產“轉基因藥物”與用細菌、酵母菌或動物細胞生產基因工程藥物相比較，最大的優(yōu)點是產量高，另一大優(yōu)點是成本低，再者轉基因產品具有與人體自身產生的蛋白相同的生物學活性。這些動物的乳腺細胞能進行一系列的翻譯后修飾作用，包括糖基化和γ羧化作用等，正確地產生人體蛋白。

2．人型單克隆抗體的制備。有幾條可供采用的技術路線。一是在鼠型單克隆抗體分子中用蛋白質工程的方法更換一段人抗體分子中與抗原結合的鏈段。二是從人鼠雜交瘤細胞中直接克隆人抗體基因并使之在細菌中得到表達。三是將人免疫球蛋白重鏈C區(qū)基因轉入小鼠受精卵，發(fā)育成轉基因小鼠，用特定抗原免疫這種轉基因小鼠，就直接得到人型化的單克隆抗體。

3．基因治療。通過各種手段導入的外源基因在細胞中的整合位點一般是隨機的，這很可能影響基因治療的效果，甚至導致與預期目標相反的結果，80年代末興起的“基因打靶”技術能將外源基因定點整合到細胞基因組的某一確定位點上，因而能對缺陷基因進行原位修復，在今后，“基因打靶”的效率將會得到大幅度提高，使基因治療的臨床應用建立在安全可靠的基礎上。

4．生物技術的各個環(huán)節(jié)。各個環(huán)節(jié)將不斷得到改進。首先是聚合酶鏈反應及其他不斷涌現的分子生物學新技術將得到廣泛應用。同時，在細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等不同的細胞內能得到高效表達的載體將不斷地構建成功，大幅提高基因工程的生產效率。此外，生物技術后處理工程和蛋白質工程將迅速發(fā)展，通過蛋白質工程修飾和改造基因工程產品以及有目的地修飾、改造乃至重新組建蛋白質分子結構的理想將逐步實現。

三、生物技術與化學、食品工業(yè)

（四)利用生物技術開辟新的食品資源

1．單細胞蛋白――食品與飼料的新來源

蛋白質是為此生命的基本物質，全世界蛋白質缺乏的問題已存在多年，開發(fā)單細胞蛋白，正是用生物技術解決這一問題的一條重要途徑。單細胞蛋白就是從酵母或細菌等微生物菌體中獲取得蛋白質，單細胞蛋白的氨基酸組成不亞于動物蛋白質，如酵母菌體蛋白，其營養(yǎng)十分豐富，人體必需的8種氨基酸，除蛋氨酸外，它具備7種。微生物細胞中除含有蛋白質外，還含有豐富的碳水化合物以及脂類、維生素、礦物質，因此單細胞蛋白營養(yǎng)價值很高。生產單細胞蛋白質的原料來源極為廣泛，一般有四類，一是糖質原料，二是石油原料，三是石油化工產品，四是氫氣和碳酸氣，最有前途的原料是可再生的植物資源，如農林加工產品的下腳料、食品工廠的廢水下腳料等。許多國家單細胞蛋白的生產已具有很大的規(guī)模，取得了豐碩的成果。單細胞蛋白在飼料和食品工業(yè)中有著極重要的作用。單細胞蛋白作為飼料蛋白，已被世界廣泛采用。例如用假絲酵母及產盶酵母作為菌種，利用亞硫酸廢液或石油生產酵母菌體，可用于牲畜飼料，以酵母菌和假絲酵母菌生產的單細胞蛋白，可直接用作人的食品。單細胞蛋白在食品加工中也有著重要作用，它能提高食品的物理性能、風味等。

1． 制糖工業(yè)的巨大變革――淀粉糖的生產

傳統(tǒng)制糖工業(yè)主要以甘蔗、甜菜為原料生產蔗糖，糖原不足、價格昂貴與產品甜度不高是制糖工業(yè)面臨的大難題。生物技術在這里發(fā)揮了巨大的作用，首先，食品科學家將糖源目標轉移向來源充足、價格低廉的淀粉，其次，為了提高產品的甜度，食品科學家使用葡萄糖異構體酶成功地將葡萄糖轉化為甜度遠高于蔗糖的果糖，產品稱為高果糖漿。近年來，采用酶工程還成功地將淀粉加工成為飴糖、麥芽糖、高麥芽糖漿、麥芽糊精、偶聯糖等各類淀粉糖產品，它們在食品工業(yè)中均起重要作用。淀粉糖的生產作為制糖工業(yè)的一大變革，其經濟效益十分顯著。目前這種新型低價糖正逐步替代蔗糖，廣泛應用于各類食品和飲料。

（五)利用生物技術提高食品品質

1．食品添加劑。①酸味劑。發(fā)酵工程在酸味劑的生產中顯示了巨大的作用，例如發(fā)酵法制得的L-蘋果酸是國際食品界公認的安全性食品添加劑，是加工果醬、果汁、飲料、合成酒、罐頭、糖果、人造奶油等地優(yōu)選酸味劑之一。②甜味劑。天冬氨素是一種低熱甜味劑，其甜度高達蔗糖的200倍，世界各國已大量生產利用，過去是采用化學方法合成，又兩個缺點，一是產生有苦味的β－型體，必須純化除去，二是工藝較為復雜，生產成本偏高，改用酶法合成新工藝，可降低成本，提高產量。③鮮味劑。味精又稱L－谷氨酸鈉,具有強烈的肉類鮮味，過去主要用天然蛋白質水解制得，而今普遍采用糖質原料進行發(fā)酵法生產。鳥苷酸和肌苷酸為新型鮮味劑，它們與味精混合使用能成倍地提高鮮味，這些呈味核苷酸與味精混合作為復合調味料，國際市場上稱作強力味精，是極有發(fā)展前途的調味品，在食品工業(yè)總具有很重要的地位。發(fā)酵工程在這兩種新型鮮味劑的生產中也發(fā)揮了巨大的作用，例如采用產氮短桿菌突變株進行直接發(fā)酵生產，肌苷酸產量可達20g/升，鳥苷酸3g/升。

2．用于食品加工中的酶。①肉類和魚類加工。酶在肉類和魚類加工中的主要作用在于：改善組織，嫩化肉類；轉化廢棄蛋白；魚類解凍脫腥等。②蛋品加工。采用生物技術新成果——用葡萄糖氧化酶處理禽蛋白中的微量葡萄糖，使氧化成葡萄糖酸，可有效阻止葡萄糖的醛基與蛋白質、氨基酸等的氨基發(fā)生羧氨反應導致的蛋白的褐變，該法效率高，周期短，并可改善環(huán)境衛(wèi)生。③乳品工業(yè)。酶工程在乳品工業(yè)中發(fā)揮了重要作用，如用發(fā)酵法生產凝乳酶，進而用于干酪的生產；分解牛奶中的乳糖；黃油的增香；奶粉中添加卵清溶菌酶預防嬰兒腸道感染等。④果蔬加工。酶在果蔬加工中的主要作用有水果罐頭加工，如利用黑曲霉除制作橘子罐頭中需要除去的橘瓣囊衣；柑橘類脫苦，利用球形節(jié)桿菌固定化細胞的檸堿酶處理橘子中的檸檬苦素；果汁加工，利用果膠酶處理潰碎果實，加速果汁過濾，促進澄清；水果蔬菜保藏，用葡萄糖氧化酶出去脫水蔬菜中的糖分，可防止儲藏過程中發(fā)生褐變。⑤飲料、釀酒工業(yè)，白酒生產中采用糖化酶代替麩曲可提高出酒率，節(jié)約糧食，簡化設備，節(jié)省廠房場地。⑥焙烤食品。用酶活力高的面粉制成的面包，氣孔細而分布均勻，體積大，彈性好，色澤佳。

此外，生物技術在食品衛(wèi)生檢驗、食品脫毒等方面均有嶄新的貢獻。

第二章  生物藥物

一、生物藥物的概念

化學藥物、生物藥物與中草藥是人類防病、治病的三大藥源。生物藥物（Biopharmaceutics)是利用生物體、生物組織或其成分，綜合應用生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學等的原理與方法制造的一大類用于預防、診斷、治療的制品。廣義的生物藥物包括從動物、植物、微生物等生物體中制取的各種天然生物活性物質及其人工合成或半合成的天然物質類似物。隨著基因重組藥物、基因藥物和單克隆抗體的快速發(fā)展，生物藥物已獲得極大的擴充，現代生物藥物已形成四大類型：①基因重組多肽、蛋白質類治療劑，即應用重組DNA技術（包括基因工程技術、蛋白質工程技術)制造的重組多肽、蛋白質類藥物；②基因藥物，即基因治療劑、基因疫苗、反義藥物和核酶等；③天然生物藥物，即來自動物、植物、微生物和海洋生物的天然產物；④合成與部分合成生物藥物。其中①②類屬生物技術藥物，在我國按“新生物制品”研制申報。③④類視來源不同可按化學藥物或中藥類研制申報。

二、生物藥物的發(fā)展

生物藥物是一類既古老又年青的新型藥物。中國古代勞動人民曾對生物藥物的產生與發(fā)展做出過重要的貢獻，如公元前597年就發(fā)明了用（類似植物淀粉酶制劑)治療消化不良，又如公元11世紀沈括發(fā)明的秋石治病更是生物藥物早期成功應用的實例。

早期的生物藥物多數來自動物臟器，有效成分也不明確，曾有臟器制劑之稱。到20世紀20年代，對動物臟器的有效成分逐漸有所了解。純化胰島素、甲狀腺素、各種必需氨基酸、必需脂肪酸、以及多種維生素開始用于臨床或保健。20世紀40～50年代相繼發(fā)現和提純了腎上腺皮質激素和垂體激素，使這類藥物的品種日益增加。50年代起開始應用發(fā)酵法生產氨基酸類藥物，60年代以來，從生物體分離、純化酶制劑的技術日趨成熟，酶類藥物很快獲得應用。尿激酶、鏈激酶、溶菌酶、天冬酰胺酶、激肽釋放酶等已成為具有獨特療效的常規(guī)藥物。近20年來，生物藥物中的生化藥物品種迅速增加。全世界已報道的生化藥物總計250種左右。改革、開放的20年來，我國生化藥物的發(fā)展也十分迅速，品種已從70年代的100個發(fā)展至今為130多個品種。目前，國外已正式生產的主要品種，我國多數已有產品或正在研制，還獨創(chuàng)了一些新品種，如天花粉蛋白，人工牛黃等。

自1982年人胰島素成為用DNA重組技術生產的第一個藥物上市以來，生物技術藥物的研制與開發(fā)取得了飛速的發(fā)展。

生物制品最早的實踐應用也在我國，例如早在10世紀，我國民間就有種痘預防天花的實踐。1796年英國醫(yī)生琴納發(fā)明了預防天花的牛痘苗，從此用生物制品預防傳染病的方法才得到肯定。20世紀以來，隨著病毒培養(yǎng)技術的發(fā)展，疫苗種類日益增加，制造工藝日新月異。特別是80年代后期，應用基因工程技術研制成功乙肝疫苗、狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗和AIDS病疫苗。使得各種免疫診斷制品和治療用生物制品也迅速發(fā)展，如各種單克隆抗體診斷試劑、甲肝診斷試劑、乙肝診斷試劑、丙肝診斷試劑、風疹病毒、水痘病毒診斷試劑、α-干擾素、γ-干擾素、白介素-2、血凝因子Ⅷ、轉移因子等都已相繼投放市場。

按照生物藥物產品的純度、工藝特點和臨床療效特征，生物藥物的發(fā)展大致經歷了三個發(fā)展階段。第一代生物藥物是利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質與混合成分的粗制劑，如腦垂體后葉制劑，腎上腺提取物，眼制劑，骨制劑，胎盤制劑等。這類產品的特點是有效成分不明確，制造工藝簡單，但確有一定的療效。因此，這類產品在歐亞地區(qū)，尤其在第三世界國家和日本等地仍然還有某些新制劑出現。第二代生物藥物是根據生物化學和免疫學原理，應用近代生化分離、純化技術從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分或合成與部分合成的產品，如胰島素、尿激酶、肝素鈉、香菇多糖、前列腺素E、人丙種球蛋白、轉鐵蛋白、狂犬病免疫球蛋白等。這類產品的特點是成分明確，療效確切，雖然某些產品的原料來源有限，但隨著新的生物活性物質的不斷發(fā)現，第二代生物藥品仍將日益增多，具有廣闊的前景。第三代生物藥物是應用現代生物技術生產的天然生物活性物質以及通過蛋白質工程原理設計制造的具有比天然物質更高活性的類似物或與天然品結構不同的全新的藥理活性成分。如利用基因工程技術生產的人胰島素、α-干擾素、白介素-2、乙肝疫苗以及用PEG修飾的干擾素等。由于世界各國的技術和資源的利用情況不同，因此上述三代生物藥物目前仍處于并存、競爭與相互補充、共同發(fā)展的局面。

三、生物藥物的特性

1．藥理學特性

（1)治療的針對性強  治療的生理、生化機制合理，療效可靠。如細胞色素c為呼吸鏈的一個重要成員，用它治療因組織缺氧所引起的一系列疾病，效果顯著。

（2)藥理活性高  生物藥物是從大量原料中精制出來的高活性物質，因此具有高效的藥理活性。如注射純的ATP可以直接供給機體能量，效果確切、顯著。

（3)毒副作用小，營養(yǎng)價值高  生物藥物主要有蛋白質、核酸、糖類、脂類等。這些物質的組成單元為氨基酸、核苷酸、單糖、脂肪酸等，對人體不僅無害而且還是重要的營養(yǎng)物質。

（4)生理副作用常有發(fā)生  生物藥物是從生物原料制得的。生物進化的結果使不同生物，甚至相同生物的不同個體之間的活性物質的結構都有很大差異，其中尤以相對分子質量(Mr)較大的蛋白質(含酶)更為突出。這種差異使在用生物藥物時表現出副作用，如免疫反應、過敏反應等。

2．在生產、制備中的特殊性

（1)原料中有效物質含量低  雜質種類多且含量高，因此提取、純化工藝復雜。如胰腺中胰島素含量僅為0.002%，還含有多種酶、蛋白質等雜質，提純工藝就很復雜。

（2)穩(wěn)定性差  生物藥物的分子結構中一般具有特定的活性部位，生物大分子藥物是以其嚴格的空間構象來維持其生物活性功能的，一旦遭到破壞，就失去其藥理作用。引起活性破壞的因素有：生物性的破壞，如被自身酶水解等；理化因素的破壞，如溫度、壓力、pH、重金屬等。

（3)易腐敗  由于生物藥物原料及產品均為營養(yǎng)價值高的物質，因此極易染菌、腐敗，從而造成有效物質被破壞，失去活性，并且產生熱源或致敏物質等。因此生產過程中對于低溫、無菌操作要求嚴格。

（4)注射用藥有特殊要求  生物藥物由于易被胃腸道中的酶所分解，所以給藥途徑主要是注射用藥，因此對藥品制劑的均一性、安全性、穩(wěn)定性、有效性等都有嚴格要求。同時對其理化性質、檢驗方法、劑型、劑量、處方、貯存方式等亦有明顯的要求。

3．檢驗上的特殊性

由于生物藥物具有特殊的生理功能，因此生物藥物不僅要有理化檢驗指標，更要有生物活性檢驗指標。這也是生物藥物生產的關鍵。

四、生物藥物的分類、種類

（一)分類

生物藥物的分類大致歸納為三種方法：按藥物的來源物制造方法分類；按藥物的化學本質和化學特性分類；按藥物的生理功能和臨床用途分類。

（一)按其來源和制造方法對生物藥物分類

1．動物來源   許多生物藥物來源于動物臟器。近年來，盡管從植物、微生物來源的生物藥物逐年增加，但動物來源的生物藥物仍占較大比重。尤其是我國，家畜(豬、馬、牛、羊等)、家禽(雞、鴨等)和海洋生物資源豐富，具有大力開展綜合利用的條件和資源。

2．微生物來源 應用微生物發(fā)酵法生產生物藥物是一個重要途徑。其優(yōu)點是：

（1)微生物及其代謝物資源豐富，可開發(fā)的潛力很大。

（2)微生物易于培養(yǎng)，繁殖快，產量高，成本低，便于大規(guī)格工業(yè)生產，不受原料運輸、保存、生產季節(jié)和貨源供應的影響。

（3)微生物發(fā)酵法生產生物藥物可綜合利用，從代謝物和菌絲體都可以制取許多種生物藥物，并且通過誘變育種選育良種，或用加入前體培養(yǎng)法大幅度提高產量。

（4)利用微生物體內酶的轉化作用進行生物藥物的半合成具有重要意義。許多復雜的難以實現的反應，利用微生物酶能專一和迅速地完成。

現階段利用微生物發(fā)酵法生產的生物藥物有許多種類。以氨基酸、核酸及其降解物，酶和輔酶等的生產規(guī)模較大，其次在多肽、蛋白質、糖、脂、維生素、激素及有機酸的生產上也有不少產品。

3．植物來源 我國藥用植物的資源極為豐富。過去在研究藥用植物時，往往忽視了其所含有的生化成分，常常把植物中的生物大分子物質當做雜質除去而未能利用。近幾年來，對植物中的蛋白質、多糖、脂類和核酸類等生物大分子的研究和利用引起人們的重視，從而出現了許多新的生物藥物資源。

4．現代生物技術產品 包括利用基因工程技術生產的重組活性多肽、活性蛋白質類藥物、基因工程疫苗、單克隆抗體及多種細胞生長因子，利用轉基因動、植物生產的生物藥物及利用蛋白質工程技術改造天然蛋白質，創(chuàng)造自然界沒有的但功能上更優(yōu)良的蛋白質類生物藥物。利用現代生物技術生產生物藥物將是生物藥物的最重要來源。

5．化學合成 許多小分子生物藥物已能用化學合成或半合成法進行生產。如氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、維生素和某些激素。并且通過結構改造以達到高效、長效和高專一性。有些大分子生物藥物如酶也可通過化學修飾以提高其穩(wěn)定性和降低抗原性。

生物藥物按其來源不同雖可按上述分類，但許多產品是由幾種來源相結合產生的。例如基因工程產品既有動、植物來源，也有微生物來源。甾體激素可視為植物、微生物和化學合成相結合的產物。某些氨基酸和維生素C也是化學合成和微生物發(fā)酵相結合的。

（二)按藥物的化學本質和化學特性來分

生物藥物的有效成分多數是比較清楚的，該分類方法有利于比較一類藥物的結構與功能的關系、分離制備方法的特點和檢測方法的統(tǒng)一等。因此一般教科書均按此來分類。計有：

1．氨基酸及其衍生物類藥物

這類藥物包括天然的氨基酸和氨基酸混合物，以及氨基酸衍生物，如N-乙酰半胱氨酸、L-二羥基苯丙氨酸等。

2．多肽和蛋白質類藥物

多肽和蛋白質的化學本質是相同的，性質又相似，但分子量不同，在生物學上性質差異則較大，如分子大小不同的物質免疫原性就不一樣。蛋白質類藥物，有血清白蛋白、丙種球蛋白、胰島素等；多肽類藥物，有催產素、降鈣素、胰高血糖素等。

3．酶與輔酶類藥物

酶類藥物可按其功能分為：消化酶類、消炎酶類、心腦血管疾病治療酶類、抗腫瘤酶類、氧化還原酶類等。輔酶種類繁多，結構各異，一部分輔酶亦屬于核酸類藥物。

4．核酸及其降解物和衍生物類藥物

這類藥物包括核酸（DNA，RNA)、多聚核苷酸、單核苷酸、核苷、堿基等。人工化學修飾的核苷酸、核苷、堿基等的衍生物，如5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤等，亦屬于此類藥物。

5．糖類藥物

糖類藥物以粘多糖為主。多糖類藥物的特點是具有多糖結構，由糖苷鍵將單糖連接而成。但由于單糖結構糖苷鍵的位置不同，因而多糖種類繁多，藥理功能各異。這類藥物存在于各種生物中。

6．脂類藥物

這類藥物具有相似的性質，能溶于有機溶劑而不易溶于水，而在化學結構上差異又較大。這類藥物，主要有脂肪和脂肪酸類、磷脂類、膽酸類、固醇類、卟啉類等。

7．細胞生長因子類

細胞因子是人類或動物各類細胞分泌的具有多種生物活性的因子。細胞生長因子類藥物是近年來發(fā)展最迅速的生物藥物之一，也是生物技術在該領域中應用最多的產品，如基因工程白細胞介素(IL)、紅細胞生成素(EPO)等。它們的功能是在體內對人類或動物細胞的生長與分化起重要調節(jié)作用。近10年人們廣泛研究的細胞因子有干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子等四大系列十幾種細胞因子。

8．生物制品類

從微生物、原蟲、動物或人體材料直接制備或用現代生物技術、化學方法制成作為預防、治療、診斷特定傳染病或其他疾病的機制，統(tǒng)稱為生物制品。

（三)按生理功能和用途分類

生物藥物廣泛用作醫(yī)療用品，在醫(yī)學、預防醫(yī)學、保健醫(yī)學等領域都發(fā)揮著重要作用。按用途分類，大致可分為四大類：

1．治療藥物

生物藥物對許多常見病、多發(fā)病有著很好的療效。尤其對于疑難雜癥，如腫瘤、艾滋病、心腦血管疾病、免疫性疾病、內分泌障礙等，生物藥物的治療效果是其他藥物不可比擬的。因此，治療疾病是生物藥物的主要功能。

2．預防藥物

以預防為主是我國醫(yī)療衛(wèi)生工作的一項重要方針。許多疾病，尤其是傳染性疾病，如天花、麻疹、百日咳等，預防比治療更為重要。常見的預防藥物有菌苗、疫苗、類毒素等。生物藥物在預防疾病方面將顯示出越來越重要的地位。

3．診斷藥物

大部分臨床診斷試劑都來自生物藥物，這也是生物藥物的重要用途之一。生物藥物作為診斷試劑的特點是：速度快，靈敏度高，特異性強。現已成功使用的有：免疫診斷試劑、單克隆抗體診斷試劑、酶診斷試劑、放射性診斷藥物和基因診斷藥物等。一些生物活性物質亦是檢測疾病的指標，如谷草轉氨酶等。

4．其他生物醫(yī)藥用品

生物藥物在其他方面應用也很廣泛，如生化試劑、保健品、化妝品、食品、醫(yī)用材料等。

五、藥典及地方標準收載的品種

（A)中華人民共和國藥典收載的品種

1．不同年版中華人民共和國藥典收載的生物藥物品種見表2-1。

表2-1  中國藥典收載的生物藥物品種

*由于個別品種尚未明確歸屬，故此品種數僅供參考。

2．1995年版中華人民共和國藥典收載的生物藥物

1995年中國藥典收載的生物技術藥物主要有（只列大類，多種制劑)：乙酰半胱氨酸、人血丙種球蛋白、人胎盤白蛋白、去氫膽酸、甘氨酸、甲狀腺粉、絲氨酸、色甘酸鈉、抑肽酶、谷氨酸、肝素鈉、尿激酶、明膠、吸收性明膠海綿、細胞色素C、玻璃酸鈉、胃蛋白酶、亮氨酸、絨白酶、胰酶、硫酸魚精蛋白、鵝去氧膽酸、縮宮纈氨酸、凝血酶、糜蛋白酶。

3．2000年版中華人民共和國藥典新增品種

2000年中國藥典擬新增品種主要有：右酐鐵、右酐40、70、尿激酶（高單位)、激肽釋放酶、門冬酰胺酶、輔酶A、輔酶Q₁₀、重組人生長激素、重組人胰島素等。

（二)衛(wèi)生部藥品標準收載的品種

不同年版部頒標準收載的品種見表2-2

表2-2  不同年版部頒標準收載的生物藥物品種

其中有數種氨基酸已升為藥典標準，收載于中國藥典1995年版1998年增補本。

（三)省、自治區(qū)、直轄市收載的藥品標準品種

《中華人民共和國省、自治區(qū)、直轄市藥品標準匯編》1989年版共收載了1985年10月31日以前地方標準生產的藥物3325種，其中生物藥物495種，占總數的14.9%。這些品種的一部分現已升到國家部頒標準或藥典標準。

（四)國家新批準的生物藥物品種

1985年～1998年國家新批準生產的生物藥物97種（基因工程藥物另統(tǒng)計)，主要有：三氮唑核苷、阿昔洛韋、單磷酸阿糖腺苷、尿激酶、蚓激酶、膠原酶、各種處方的氨基酸注射擊液、尿促性素、天花粉蛋白、縮宮素（凍干)、中性胰島素注射液、血卟啉、促肝細胞生長素、果糖二磷酸鈉、乳果糖、玻璃酸鈉、利巴韋林、肝素鈉（乳膏)、沙霉肽酶、抑肽酶、蘄蛇酶、脾氨肽（口服液)、脂肪乳、復合乳酸菌（膠囊)、胸腺五肽、低分子肝素鈉、胸腺蛋白（口服液)、甘糖酯、海藻酸鈣海綿、異丙肌苷等�；�因工程藥物有18種：生組人α-干擾素1 b 、重組人α-干擾素2α、2 b、重組人g-干擾素、重級組人白介純素-2、重組鏈激、重組人堿性成纖維細胞生長因子、重組人粒細胞集落刺激因子、重組人粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子、重組人促細細胞生成素、重組血小板衍生的生長因子、胸苷激酶基因工程細胞制劑、乙肝疫苗、痢疾疫苗等。

（五)目前已批準進入臨訂研究的生物藥物品種

目前已批準進入臨訂研究和待茲準生產的生物藥物品種主在有：牛肺表而活性劑、尿胰蛋白酶抑制劑、柞蠶素、纖維蛋白粘合膠、巴曲酶、胞二磷膽堿（膠囊)、促細胞能肛謝素、磷脂（膠丸)、谷胱甘肽、降鈣素、果糖二磷酸鈉（膠囊；口服液，海藻酸鉀，甲狀腺滴眼液、腺原酶、門冬氨酸鈣、腦細胞調節(jié)不比，前列腺素E、胸腺素  d、胸腺肽D因子、酰半胱氨酸、門冬酸鳥氨酸、左旋甲狀腺素鈉、脲苷等。

六、生物藥物的臨床用途

（一)作為治療藥物

對許多常見病和多發(fā)病，生物藥物都有較好的療效。對目前危害人類健康最嚴重的一些疾病如腫瘤、糖尿病、心血管疾病、乙型肝炎、內分泌障礙、免疫性疾病，遺傳病和延緩機體衰老等生物藥物將發(fā)揮更好的治療作用。按其藥理作用主要有以下幾大類。

1．內分泌障礙治療劑 如胰島素、生長素、甲狀腺素、胰高血糖素等。

2．維生素類藥物 主要起營養(yǎng)作用，用于維生素缺乏癥。某些維生素，大劑量使用時有一定治療和預防癌癥、感冒和骨病的作用，如維生素C、維生素D₃、維生素B₁₂、維生素B₁₄等。

3．中樞神經系統(tǒng)藥物 如L-多巴(治神經震顫)、人工牛黃(鎮(zhèn)靜抗驚厥)、腦啡肽(鎮(zhèn)痛)。

4．血液和造血系統(tǒng)藥物 常見的有抗貧血藥(血紅素)、抗凝藥(肝素)、纖溶劑-抗血栓藥(尿激酶，組織纖溶酶原激活劑，蛇毒溶栓酶)、止血藥(凝血酶)、血容量擴充劑(右旋糖酐)、凝血因子制劑(凝血因子Ⅷ和Ⅸ)。

5．呼吸系統(tǒng)藥物 有平喘藥(前列腺素、腎上腺素)、祛痰劑(乙酰半胱氨酸)、鎮(zhèn)咳藥(蛇膽、雞膽)，慢性氣管炎治療劑(核酪注射劑)。

6．心血管系統(tǒng)藥物 有抗高血壓藥(甲巰丙脯酸、激肽釋放酶)、降血脂藥(彈性蛋白酶、 豬去氧膽酸)、冠心病防治藥物(硫酸軟骨素A、類肝素、冠心舒)。

7．消化系統(tǒng)藥物 常見的有助消化藥(胰酶、胃蛋白酶)、潰瘍治療劑(胃膜素、維生素U)、止瀉藥(鞣酸蛋白)。

8．抗病毒藥物 主要有三種作用類型：①抑制病毒核酸的合成，如碘苷、三氟碘苷；②抑制病毒合成酶，如阿糖腺苷，無環(huán)鳥苷；③調節(jié)免疫功能，如異丙肌苷，干擾素。

9．抗腫瘤藥物 主要有核酸類抗代謝物(阿糖胞苷，6-巰基嘌呤，5-氟尿嘧啶)，抗癌天然生物大分子(天冬酰胺酶、PSK)，提高免疫力抗癌劑(白介素-2，干擾素，集落細胞刺激因子)。

10．抗輻射藥物 如超氧化物歧化酶(SOD)，2-巰基丙酰甘氨酸(MPG)。

11．計劃生育用藥   有口服避孕藥(復方炔諾酮)和早中期引產藥(前列腺素及其類似物，PGE₂、PGF_2α、15-甲基PGF_2α、16，16-二甲基PGF_2α)。

12．生物制品類治療藥 如各種人血免疫球蛋白(破傷風免疫球蛋白、乙型肝炎免疫球蛋白)、抗毒素(精制白喉抗毒素)和抗血清(蛇毒抗血清)等。

隨著生物技術的迅猛發(fā)展，新的生物技術藥物不斷涌現，使生物藥物的臨床用途得到進一步的擴展。例如胚胎干細胞工程，通過使早期胚胎內細胞團或原始生殖細胞在體外分化，抑制培養(yǎng)，分離和克隆，使其發(fā)育成各種高度分化的功能細胞(如肌肉細胞、神經細胞等)，并可形成各種組織和器官，從而有望用于修復那些人體已不能再生的壞損組織和器官，并將使許多目前無法根治的疾病得到治愈。又如，反義藥物是以反義核酸技術為基礎開發(fā)的生物技術藥物，與傳統(tǒng)生物藥物相比，反義藥物作為治療藥物，其性質、作用對象明顯不同，主要表現為：①新的化學物質——寡聚核苷酸；②新的藥物受體—mRNA；③新的藥物—受體結合后反應。從而使其已逐步應用于癌癥治療、抗病毒、心血管疾病治療及阿爾茨海默病等各種疾病的治療方面。

（二)作為預防藥物

以預防為主的方針是我國醫(yī)療衛(wèi)生工作的一項重要戰(zhàn)略。許多疾病，尤其是傳染病(如細菌性和病毒性傳染病)的預防比治療更為重要。通過預防，許多傳染病得以控制，直到滅絕，如我國已消滅的天花、鼠疫就是廣泛開展預防接種痘苗、鼠疫菌苗所取得的重大成果。

常見的預防藥物有菌苗、疫苗、類毒素及冠心病防治藥物(如：改構肝素及多種不飽和脂肪酸)。菌苗有活菌苗，死菌苗及純化或組分菌苗�；罹�苗如布氏桿菌病、鼠疫、土拉、炭疽和卡介苗等。純化或組份菌苗如流行性腦膜炎、多糖菌苗，死菌苗如霍亂、傷寒、百日咳、鉤端螺旋體菌苗等。疫苗也有滅活疫苗(死疫苗)和減毒疫苗(活疫苗)二類。死疫苗如乙型腦炎、森林腦炎、狂犬病和斑疹傷寒疫苗，活疫苗如麻疹、 脊髓灰質炎、腮腺炎、流感、黃熱病疫苗等。類毒素是細菌繁殖過程中產生的致病毒素，經甲醛處理使失去致病作用，但保持原有的免疫原性的變性霉素，如破傷風類毒素和白喉類霉素。

近幾年發(fā)展起來的基因疫苗(genetic vaccination)使作為預防用的生物藥物得到進一步發(fā)展�；�因疫苗也稱DNA疫苗，是將外源基因克隆在表達質粒上，直接注入到動物體內，使其外源基因在活體內表達抗原并誘導機體產生免疫應答，產生抗體從而激活免疫力。DNA疫苗已經在許多難治性感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病和腫瘤性疾病的預防領域顯示出廣泛的應用前景。

（三)作為診斷藥物

生物藥物用作診斷試劑是其最突出又獨特的另一臨床用途，絕大部分臨床診斷試劑都來自生物藥物。診斷用藥有體內(注射)和體外(試管)兩大使用途徑。診斷用藥發(fā)展迅速，品種繁多，數可近千，劑型也不斷改進，正朝著特異、敏感、快速、簡便方向發(fā)展。

1．疫診斷試劑 利用高度特異性和敏感性的抗體機體反應，檢測樣品中有無相應的抗原或抗體，可為臨床提供疾病診斷依據，主要有診斷抗原和診斷血清。常見診斷抗原有：①細菌類，如傷寒、副傷寒菌、布氏菌、結核菌素等；②病毒類，如乙肝表面抗原血凝制劑、乙腦和森腦抗原、麻疹血凝素；③毒素類，如鏈球菌溶血素O、錫克及狄克診斷液等。診斷血清包括：①細菌類(如痢疾菌分型血清)；②病毒類(如流感腸道病毒診斷血清)；③腫瘤類(如甲胎蛋白診斷血清)；④抗毒素類(如霍亂OT)；⑤激素類(如絨毛膜促性腺激素HCG)；⑥血型及人類白細胞抗原診斷血清(包括抗人五類Ig和K，λ輕鏈的診斷血清)；⑦其他類，如轉鐵蛋白診斷血清。

2．酶診斷試劑 利用酶反應的專一性和快速靈敏的特點，定量測定體液內的某一成分變化作為病情診斷的參考。商品化的酶診斷試劑盒是一種或幾種酶及其輔酶組成的一個多酶反應系統(tǒng)，通過酶促反應的偶聯，以最終反應產物作為檢測指標。經常用于配制診斷試劑的酶有氧化酶、脫氫酶、激酶和水解酶等。已普遍作用的常規(guī)檢測項目有血清膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、血氨、ATP、尿素、乙醇及血清SGPT(谷丙轉氨酶)和SGOT(谷草轉氨酶)等。目前已有40余種酶診斷試劑盒供臨床應用，如HCG診斷盒，艾滋病診斷盒。

3．器官功能診斷藥物 利用某些藥物對器官功能的刺激作用、排泄速度或味覺等以檢查器官的功能損害程度。如磷酸組胺，促甲狀腺素釋放激素，促性腺激素釋放激素，胰功肽(BT-PABA)，甘露醇等。

4．放射性核素診斷藥物 放射性核素診斷藥物有聚集于不同組織或器官的特性，故進入體內后，可檢測其在體內的吸收、分布、轉運、利用及排泄等情況，從而顯出器官功能及其形態(tài)，以供疾病的診斷。如¹³¹碘化血清白蛋白用于測定心臟放射圖及心輸出量，腦掃描；氰⁵⁷鈷素用于診斷惡性貧血；檸檬酸⁵⁹鐵用于診斷缺鐵性貧血；⁷⁵硒-蛋氨酸用于胰臟掃描和淋巴瘤、淋巴網狀細胞瘤和甲狀旁腺組織瘤的診斷。

5．診斷用單克隆抗體(MCAb)  McAb的特點之一是專一性強，一個B細胞所產生的抗體只針對抗原分子上的一個特異抗原決定簇。應用McAb診斷血清能專一檢測病毒、細菌、寄生蟲或細胞之分子量很小的一個抗原分子片段，因此測定時可以避免交叉反應。McAb診斷試劑已廣泛用于測定體內激素的含量(如HCG、催乳素、前列腺素)，診斷T淋巴細胞亞群和B淋巴細胞亞群及檢測腫瘤相關抗原。McAb對病毒性傳染原的分型分析，有時是唯一的診斷工具，如脊髓灰質炎有毒株或無毒株的鑒別，登革熱不同型的區(qū)分，腎病綜合征的診斷等。

6．基因診斷芯片 基因診斷芯片是基因芯片(Genechip, DNA chip)的一大類，它是將大量的分子識別基因探針固定在微小基片上，與被檢測的標記的核酸樣品進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交強度而獲得大量基因序列信息(特別是與疾病相關的信息)。目前主要用于疾病的分型與診斷，如用于急性脊髓白血病和急性淋巴母細胞白血病的分型，以及對乳腺癌、前列腺癌的分型及各類癌癥或其他疾病的基因診斷。

（四)用作其他生物醫(yī)藥用品

生物藥物應用的另一個重要發(fā)展趨勢就是滲入到生化試劑、生物醫(yī)學材料，營養(yǎng)、食品及日用化工，保健品和化妝品等各個領域。

1．生化試劑 系列生化試劑品種繁多，不勝枚舉，如細胞培養(yǎng)劑，細菌培養(yǎng)劑，電泳與層析配套試劑，DNA重組用的一系列工具酶、植物血凝素，同位素標記試劑和各種抗血清與免疫試劑等。

2．生物醫(yī)學材料 主要用于器官的修復、移植或外科手術矯形及創(chuàng)傷治療等的一些生物材料。如止血海綿，人造皮，牛、豬心臟瓣膜，人工腎臟，人工胰臟等。

3．營養(yǎng)保健品及美容化妝品 這類藥物已滲入到廣大人民的日常生活中，前景可觀。如各種軟飲料及食品添加劑的營養(yǎng)成分，包括多種氨基酸、維生素、甜味劑、天然色素以及各種有機酸，如蘋果酸、檸檬酸、乳酸等。另外眾多的酶制劑(如SOD) 、生長因子(如EGF、bFGF)、多糖類(肝素、脂多糖)、脂類(膽固醇、不飽和脂肪酸)和多種維生素均已廣泛用于制造化妝品類，包括護膚護發(fā)、美容化妝品，清潔衛(wèi)生勞動保護用品，以及營養(yǎng)治療化妝品。

五、生化藥學與現代藥學研學——生物藥物的研究發(fā)展趨勢

（一)   應用生化藥學的理論與技術深入發(fā)現新的先導化合物

開發(fā)新藥的物質來源可以是天然資源或合成的化合物，從眾多候選化合物中發(fā)現具有進一步研究和開發(fā)意義的物質，也即先導化合物，是研究新藥的起始步驟。一旦發(fā)現新結構及特殊藥理作用的新藥。

從天然產物中發(fā)現先導化合物是新藥研究的重要方面，尤其是對治療疑難重癥的新藥發(fā)現更寄希望于天然產物。從天然產物中尋找防治腫瘤、艾滋病、抗病毒、抗衰老、溶栓等藥物是新藥研究的熱點，從各國民間傳統(tǒng)藥中尋找先導化合物也受到很大重視。

在現有上市藥物中，屬于天然來源的約占1/4，由于分離技術和結構，極大地豐富了天然產物的來源，現已開發(fā)出多種受到臨床上重視的新藥，如三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、10-羥基喜樹堿和9-氨基喜樹堿以及由鬼臼毒素衍生出來的VP-16和VM-26等抗腫瘤藥物，還有新型抗瘧藥青蒿素和治療卵巢瘤等實體瘤的新藥紫杉醇以及冠心病防治藥銀杏黃酮、內酯等。

微生物藥物主要包括抗生素和微生物代謝產物。已廣泛應用的抗生素至少有100多種；已發(fā)現的抗生素達9000多種，人工半合成抗生素、微生物酶抑制劑和免疫調節(jié)劑是當前微生物藥物的主要發(fā)展方向。如HMG-CoA(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A)還原酶抑制劑洛伐他丁(Lovastatin)的年銷售額已達10億美元；環(huán)孢素是有效的免疫抑制劑，對器官移植的抗排斥反應有突出臨床效果。在現有微生物藥物研究中，抗細菌、抗真菌、抗癌、殺蟲等藥物所占比例相近，合計約占50％，其他生理活性物質占50％，如圖2-1所示�？拱╊�(包括抑制蛋白激酶C)，抑制腫瘤血管新生作用；循環(huán)系統(tǒng)類藥物 (包括拮抗內皮素)，抑制磷酸二酯酶，抗血小板凝集作用；降血脂類(包括抑制膽固醇�；�轉移酶)，抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶；還有抗炎、抗過敏，免疫抑制劑、抗HIV等活性物質。

圖2-1  微生物藥物研究方向示意

（JAntibiotics)

已上市的生化藥物有500多種，還有100多種臨床診斷試劑。主要有氨基酸類、多肽蛋白質類、核酸類、多糖類、脂類和細胞因子等。最近在肝細胞生長因子、腦活素、神經節(jié)苷脂、蚓激酶、蛇毒抗栓酶、低分子量肝素、UTI、肺表面活性物質(PS)和抗菌肽等方面的研究都取得了突出成果，尤其是神經肽和細胞因子的研究進展更為迅速。已發(fā)現的神經肽達50種，已成為神經生物學最活躍的研究領域之一。已發(fā)現的細胞因子達100多種， 如EPO，TPO，G-CSF，M-CSF，GM-CSF，EGF，NGF，IL-2，IFN，TNF，BDGF等均已在臨床應用。從天然產物中尋找具有特殊活性的微量多肽蛋白作為發(fā)現新藥的先導化合物正方興未艾，如水蛭素、蜂毒多肽、蜱抗凝肽和犬鉤蟲抗凝肽A-CAP等均為新型溶栓藥物的研究熱點。

海洋藥物的研究也是新藥開發(fā)的活躍領域。美國國立腫瘤研究所每年篩選3萬個新的 抗癌化合物，有5％來自海洋生物。海洋動物提取物中有10％具有抗癌活性，3.5％海洋植物提取物有抗癌和細胞毒活性。已發(fā)現的3萬多種海洋生化物質，主要具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗艾滋病、降壓、防治冠心病、免疫調節(jié)與抗衰老等作用。FDA已批準抗腫瘤藥物海鞘素、MLD(Manoaliede)和AIF(SCDI鯊魚軟骨提取物的新生血管抑制因子)及�？�素(PIX新型強心劑)進入臨床試驗研究。

由天然活性物質的深入發(fā)現找到結構新穎的先導化合物，設計合成出新的化學實體 (NCE)，通過對此類先導化合物的結構與功能的研究可獲得大量有效信息，以供設計和研究全新的化學實體。如人體內新的活性多肽的不斷發(fā)現，使傳統(tǒng)的生理調節(jié)基礎理論發(fā)生變化，進一步深化了對某些疾病的病理機制的認識，為新藥設計開辟了新途徑。對動物與人體的呼吸系統(tǒng)內發(fā)現的多種神經肽的研究表明，呼吸功能除受腎上腺素能神經和膽堿能神經的調節(jié)外還受非腎上腺素能和非膽堿能神經的調節(jié)。此類神經調節(jié)系統(tǒng)的遞質主要是神經肽。結果從心房中分離到心鈉素，從大腦中分離到腦鈉素，具有強大的利尿、利鈉、降壓和調節(jié)心律作用，為尋找心血管系統(tǒng)藥開辟了新領域。

以天然產物為先導化合物，通過組合化學技術合成大量的結構相關的物質建立有序變化的化合物庫供藥物篩選和藥效關系研究，如根據腦啡肽結構，將除去半胱氨酸以外的 19種氨基酸任意組合成6肽庫，合成了總肽數達52128400種，從中篩選鴉片拮抗劑，得到3種強活性多肽；為尋找抗HIV藥物，用組合化學法合成篩選了65536種硫代磷酸八聚核苷酸。應用組合化學技術超大量合成和篩選藥物的基本原理是在芯片或合成株等固相表面上進行原位合成和原位篩選。除肽類及寡核苷酸外，多糖類小分子化合物的組合化學合成法也取得進展。通過生物新藥的研究，結合組合化學技術，為擴大分子多樣性，發(fā)現先導化合物，創(chuàng)立新的化學實體，找到了一條強有力的新途徑。

（二)應用重組DNA技術建立制藥工業(yè)新門類

應用重組DNA技術和蛋白質工程技術開創(chuàng)了新藥研究的新階段，進而建立了制藥工業(yè)新門類。未來的生物制藥工業(yè)將占整個醫(yī)藥產業(yè)的1/5。歐美已上市的生物技術藥物已達84種，市場銷售額已超過195億美元，2006年將達到320億美元。已有723種生物技術藥物正在通過FDA審批(包括I～Ⅲ期臨床和FDA評估)，還有700多種生物技術藥物處于不同研究階段。有200個產品已到最后批準階段(Ⅲ期臨床和FDA評估)，有80個新品種正在或立即上市。

第一代基因工程藥物是針對因缺乏天然內源性蛋白質所引起的一些疾病，應用基因工  程技術去擴大這類多肽蛋白質的產量，主要是以蛋白質激素類為代表的如人胰島素、胰高  血糖素、人生長激素、降鈣素、促生長素(Somatotropin)、α-EPO(Erythropoietin-α)等，以替代或補充體內對這類活性多肽蛋白質的需要。

第二代基因工程藥物是根據內源性多肽蛋白質的生理活性物質(主要為細胞因子類，如G-CSF、GM-CSF、α-IFN、g-IFN和tPA等)及其衍生物，應用基因工程技術大量生產這些極為稀有物質，并通過蛋白質工程技術進一步獲得自然界不存在的新型基因工程藥物，從而為疾病治療提供了源頭性創(chuàng)新的治療劑。

在實際應用中，基因工程藥物受到一定限制，如口服應用時生物利用度低，會受到消 化酶的破壞，在胃酸作用下不穩(wěn)定，在體內半衰期較短等，因此只能注射給藥或局部用 藥。為了克服這些缺陷，已開始改為合成這些天然蛋白質的較小活性片段，即所謂“多肽 模擬”或“多肽結構域”合成，又叫“小分子結構藥物設計”。用于治療免疫缺陷癥、HIV感染、變態(tài)反應性疾病、風濕性關節(jié)炎等，其制造成本也更低。這種設計思想業(yè)已應用于多糖類藥物、核酸類藥物和模擬酶的有關研究。小分子藥物沒計屬于第二代結構相關性的合理藥物設計，所設計的分子能替代原先天然活性蛋白與特異靶相互作用。

蛋白質的分子設計就是有目的地為制造蛋白質工程藥物提供設計方案。應用蛋白質工  程技術已獲得多種自然界不存在的新型基因工程藥物，如CD4、IL-2與毒素結合的雜合蛋和PIXY₃₂₁等。蛋白質工程藥物的分子設計主要有以下方法：

（1)用突變技術更換活性蛋白質的某些關鍵氨基酸殘基，如將天然 IL-2的125位Cys點突變?yōu)镾er，所得的¹²⁵S-IL-2不會形成二聚體，比活高、熱穩(wěn)定性好、體內半衰期延長，是我國首創(chuàng)的基因工程藥物。

（2)通過增加、刪除或調整分子上的某些肽段或結構或寡糖鏈，使之改變活性，生成合適糖型，產生新的生物功能。如將E.coli表達的tPA的A鏈F、G、K_l 3個結構域除去,只留下A鏈的K₂結構域和B鏈，從而失去肝細胞識別的A鏈非糖鏈的依賴結構，結果半衰期從5～6min上升到11.6～15.4min，這種小分子tPA基因進一步在真核細胞表達，使tPA帶有糖鏈結構，其體內半衰期可達20～25min。

（3)將功能互補的兩種基因工程藥物在基因水平上融合。這種“擇優(yōu)而取”的嵌合型藥物，其功能不僅僅是原有藥物功能的加和，還會出現新的藥理作用。如IL-6與IL-2融合表達產物CH₉₂₅除具有IL-6與IL-2的活性外，還可以提高不同級別紅系祖細胞的生長。又如GM-CSF／IL-3融合蛋白PIXY₃₂₁對GM-CSF受體親和力與天然GM—CSF相同，而對IL-3受體的親和力卻比IL-3高，而且PIXY₃₂₁在較低EPO條件下能夠刺激紅系祖細胞BFO-E的形成。

（三)合理藥物設計的生化藥學理論基礎

在過去的藥物化學研究中，雖然已更多地注意以構效關系為基礎的藥物設計，但是化 學和生物醫(yī)學研究仍然沒有很好地融合。在分子層次上對生物大分子的結構與功能研究有了大發(fā)展之后，新藥研究即步入了合理藥物設計的新階段。以藥物作用的靶分子(如酶、受體、通道蛋白、基因組)的結構生物學為基礎，為合理藥物設計提供了有力的理論基礎和技術手段，并成為發(fā)現具有獨特療效的化學實體的有效途徑。合理藥物設計是對靶蛋白進行克隆、表達、分離、結晶、X-射線結構測定、結合NMR與計算機模擬與輔助設計，在原子水平上設計出可以與受體蛋白專一結合或調節(jié)受體功能的新化學實體，它大大優(yōu)越于傳統(tǒng)的隨機篩選和結構修飾法，是當代新藥研究的主流。圖2-2簡示了合理藥物設計藥物與受體相互作用及新化學實體的設計與評估的研究過程。

抗高血壓藥阿托普利(aptopril)就是通過合理藥物設計研究成功的。它與血管緊張 素轉化酶的活性中心結合，抑制血管緊張素I轉變成血管緊張素Ⅱ，防止血管壁收縮，達 到降壓作用。藥物作用的靶已從以受體蛋白為靶擴大到以酶為靶，以核酸為靶，以多糖為 靶和以通道蛋白為靶的范圍。

圖2-2 結構相關性的合理藥物設計與藥物受體相互作用的研究步驟

七、生物藥物的研究進展

（一)資源的綜合利用與擴大開發(fā)

開展綜合利用，由同一資源生產多種有效成分，達到一物多用，充分、合理地利用生物資源，不僅可以降低成本，而且可以減少三廢，提高藥品純度，減產副作用。

（A)臟器綜合利用

動物臟器如胰臟、心臟、肝臟、大腦、垂體等都含有多種激素、酶類、多糖、脂類等生理活性物質。應用現代生化技術可以由同一臟器生產若干產品。例如用心臟可以生產細胞色素C、輔酶Q₁₀；利用肝臟可以生產RNA、SOD等；利用胰臟可以生產胰島素、胰高血糖素、胰解痙多肽、胰蛋白酶、胰淀粉酶、彈性蛋白酶和激肽釋放酶等，同時又可提取花生四烯酸、飽和脂肪酸等脂類及各種氨基酸等。

（B)血液綜合利用

人血含有性質和功能不同的多種成分。大多數病人只需要一種成分，很少需要多種成分。因此最好的辦法是分離出各種成分，分別對癥使用，既可提高療效、減少副作用，又可充分利用寶貴血源。血制劑按理化性狀可分為細胞成分(有形成分)和血漿蛋白成分。前者包括紅細胞、白細胞和血小板，后者包括白蛋白、免疫球蛋白、各種凝血因子、纖維蛋白酶原和其他蛋白制劑。

（C)人尿綜合利用

人尿是來源豐富的寶貴生物資源。由人尿制取的藥物與人體成分同源，不存在異種蛋白抗原性問題。不同生理時期的尿液，所含活性成分有較大不同。如妊娠婦女與絕經婦女尿液可分別制備HCG和HMG，健康男性尿液可以制備尿激酶、激肽釋放酶、尿抑胃素、蛋白酶抑制劑、睡眠因子、CSF及EGF、TPO等。

（D) 新資源的開發(fā)利用

近幾年，新資源的開發(fā)利用不斷擴大，促使新藥研究向縱深發(fā)展。其中海洋、湖沼生物、昆蟲、毒蛇類和低等生物(如藻類)的開發(fā)、研究最引人注目。海洋生物含有抗病毒、抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、抗寄生蟲、抗凝及對心血管、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經系統(tǒng)有生理作用的物質，這些物質可作為藥物原形或直接開發(fā)為藥物。例如褐藻酸鈉(PFS)是一種水溶性雜聚多糖，具有抗凝血、降血脂、解毒、防血栓形成和改善微循環(huán)等作用，已開發(fā)為藥物；以甲殼素的幾種水解產物，選取四種氨基酸(L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸)以及苯甲酸和乙酰水楊酸作為底物，合成了六個具有較強藥效作用的化合物；從紫菜中分離的紫菜多糖，具有提高機體免疫功能，抗腫瘤、抗突變、抗肝炎等作用；從毛蚶等貝類中分離的有效成分，具有補血、降血糖等功能。此外，海蛇多肽可作為神經系統(tǒng)治療藥；從海帶中提取甘露醇合成甘露醇煙酸酯用于防治冠心��；鯊魚油含有環(huán)氧角鯊烯、2，3-醇角鯊烯，可作為抗癌劑；從蛙皮中提取抗菌多肽等。

（二)從天然存在的生理活性物質中尋找新的生物藥物

已發(fā)現的作為藥用的生理活性物質僅是機體內存在的活性物質的一小部分，許多新的活性物質正待人們去開發(fā)，所以進一步研究尚未發(fā)現的新物質和過去不認識的生理作用是尋找新藥的另一個重要方向。如從大腦、小腦發(fā)現了對記憶、睡眠、控制生育和內分泌等有影響的物質；從動物與人體的呼吸系統(tǒng)內發(fā)現多種神經肽，表明呼吸功能除受腎上腺素能神經和膽堿能神經的調節(jié)外，還受非腎上腺素能和非膽堿能神經的調節(jié)，此類神經調節(jié)系統(tǒng)的遞質主要是神經肽，結果從心房中分離到心納素，從大腦中分離到腦鈉素，它具有強大的利尿、利鈉、降血壓和調節(jié)心律作用，為尋找心血管系統(tǒng)藥開辟了新領域；各類細胞生長調節(jié)因子的發(fā)現，使免疫調節(jié)劑成批出現；還相繼發(fā)現了許多新的活性多肽，活性多糖和許多不飽和脂肪酸及一些已知成分具有新的藥理作用，如加壓素有恢復記憶力的作用，催產素有增強性欲的作用，因此國內外新藥的研究又趨向于從天然產物中尋找。

（三)利用現代生物技術大力發(fā)展生物藥物

在現代生物技術領域，醫(yī)52667788.cn/kuaiji/藥生物技術的研究、開發(fā)最活躍，進展最快，最有生命力。世界上現在近2000家生物技術公司，其中近70%從事醫(yī)藥生物技術產品的開發(fā)。生物技術應用于制藥工業(yè)，不僅可以生產出大量廉價的防治人類重大疾病的新型藥物，而且將引起制藥工業(yè)技術的重大變革。應用現代生物技術主要研究開發(fā)：①生理活性物質，②干擾素，③抗體，④疫苗，⑤抗生素，⑥維生素，⑦醫(yī)療診斷制品，⑧其他藥品。從事研究的技術領域有發(fā)酵技術，基因重組技術、蛋白質工程技術，細胞融合技術，動植物細胞大量培養(yǎng)技術，生物反應器與生化工程設備技術。

（四)利用化學合成技術創(chuàng)制新的生物藥物

眾多的天然產物除可直接開發(fā)成為有效的生物藥物外，尚可以由天然活性物質的深入發(fā)現找到結構新穎的先導化合物，設計合成新的化學實體�；蛲ㄟ^組合化學技術合成大量結構相關物質，建立有序變化的化合物庫供藥物篩選與藥效關系研究。如根據腦啡肽結構，將除去半胱氨酸以外的19種氨基酸任意組合成6肽庫，合成了總肽數達52128400種，從中篩選鴉片拮抗劑，得到3種強活性多肽。

許多結構較為簡單或分子量不大的天然活性物質可以通過化學合成生產或結構改造形成化合物。如前列腺素PGE₂或PGF_2α在其15位甲基化即可提高其穩(wěn)定性許多倍；一些活性多肽的某一氨基酸殘基組成當從L-型改為D-型后就可以成為有效的口服藥物。

（五)中西醫(yī)結合創(chuàng)制新的生物藥物

中國醫(yī)藥是一個偉大的寶庫，我國在發(fā)掘中醫(yī)中藥，創(chuàng)制具有我國特點的生物藥物方面已取得了可喜成果，如人工牛黃，天花粉蛋白，骨寧注射液，復方干擾素，藥用菌和食用菌及植物多糖等都是應用生物化學等方法整理和發(fā)掘祖國醫(yī)藥遺產及民間驗方開發(fā)研制成功的。祖國醫(yī)藥學是幾千年來我國人民與疾病作斗爭的成果，具有豐富的實踐經驗，結合現代生物技術，一定可以創(chuàng)制一批具有中西結合特色的新型藥物，如應用分子工程技術將抗體和毒素(如天花粉蛋，蓖麻毒蛋白，相思豆蛋白等)相偶聯，所構成的導向藥物(免疫毒素)是一類很有希望的抗癌藥物。

（六)努力提高產品質量，積極開發(fā)新劑型，優(yōu)化產品結構

隨著中國加入WTO日期的迫近，各國藥品紛紛在中國注冊與要求保護。中國生物藥物要想在國際競爭中立于不敗之地，必須將自己的產品與國外同類型產品作比較，找出自己的差異，其次從生產、工藝、GMP、質量、包裝等各個方面努力趕上。在這方面已有一些成功的例子，如我國生產的激肽釋放酶，其質量標準經多年的努力從6項增加到12項，產品質量與日本同類產品相比毫不遜色；尿激酶產品的比活性從原來的3.5萬IU/mg蛋白提高到10萬IU/mg蛋白，比英國藥典6.7萬IU/mg蛋白提高1/3，其質量標準在世界上居領先地位。這些實例說明老產品的技術水平和質量的提高同樣是促進生物藥物的發(fā)展，提高社會效益和經濟效益的關鍵措施。生物藥物新劑型的研究也是優(yōu)化產品結構的一個重要方面，國外的生物藥品往往是一種品種多劑型，系列化生產，利于產品開發(fā)。如凝血酶(口服、局部用藥)已開發(fā)出噴霧劑、氣霧劑等4種劑型。在這方面，國內還需努力趕上。

第三章  生物技術藥物

一、生物技術藥物的定義

生物技術藥物（也稱基因工程藥物，Biotech Drugs)，指以DNA重組技術生產的蛋白質、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物，到目前為止，世界各國利用DNA重組技術成功地生產了人胰島素、人生化激素、生長因子、r-TPA、干擾素α2a，α2b、β-1b、r-1g、EPD-α、EPO-β，IL-2、G-CSF，GM-CSF等。

自1982年第一個重組藥物——人胰島素上市以來，生物技術藥物發(fā)展到今也為二代，第一代重組藥物是一級結構與天然產物完全一致的藥物，第二代生物技術藥物是應用蛋白質工程技術制造的自然界不存在的新的重組藥物。

新生物技術藥物（New biotech drug)是重組產品（Recombinant products)概念在醫(yī)藥領域的擴大應用，并與天然生化藥物（Biochemical medicine)、微生物藥物（Microbial medicine)、海洋藥物（Marine medicine)和生物制品（Biologicals)一起歸類為生物藥物（Biopharmaceuticals)。隨著基因重組藥物、基因藥物和單克隆抗體的快速發(fā)展，生物藥物已獲得極大的擴充，并與合成藥物和中草藥并列成為我國的三大藥源�，F代生物藥物已形成四大類型：①基因重組多肽、蛋白質類治療劑，即應用重組DNA技術（包括基因工程技術、蛋白質工程技術)制造的重組多肽、蛋白質類藥物。②基因藥物，即基因治療劑、基因疫苗、反義藥物和核酶等。③天然生物藥物，即來自動物、植物、微生物和海洋生物的天然產物。④合成與部分合成生物藥物。其中①②類屬生物技術藥物，在我國按“新生物制品”研制申報。③④類視來源不同可按化學藥物或中藥類研制申報。

二、生物技術藥物的主要品種

目前，美國已上市生物技術藥物116個，并有723種正在通過FDA審批，還有700多種處于不同研究階段。

表3-1  歐美已批準的生物技術藥物品種

我國已批準上市的生物技術藥物有IFN-α1b，IFN-α2a，IFN-α2b，IFN-γ，IL-2，IL-2-¹²⁵Ser，G-CSF。GM-CSF，r-SK，EPO，EGF，EGF衍生物，bEGF，胰島素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8單抗乳膏劑，胸苷激酶基因工程細胞制劑，乙肝疫苗，痢疾疫苗共21種。

我國已有生物制藥生產企業(yè)200多家，有生產能力的60多家，已生產21個品種，年產值達40多億元，正逐年上升，并開始注意產業(yè)的群落化與集約化，如生物谷、生物城、生物醫(yī)藥城、生物島等正在逐步建立。我國主要采取“立足創(chuàng)新、集成應用、需求導向和重點突破”的戰(zhàn)略，對成熟技術，進行多學科、多領域的集優(yōu)，走“官、產、學、研、資”相結合的發(fā)展體制，力爭使我國生物醫(yī)藥產業(yè)成為國民經濟的支柱產業(yè)。

通過10多年的跟蹤研究與創(chuàng)仿相結合的開發(fā)階段，目前我國的生物技術藥物研究已開始步入自主創(chuàng)新的時期，并以“新型生物技術藥物和疫苗”作為發(fā)展重點。

表3-2  我國已批準生產的生物技術藥物和疫苗

三、生物技術藥物的研究發(fā)展趨勢

生物技術藥物的市場占有品種明顯增加，主要品種類型有疫苗、單克隆抗體、細胞因子、激素、抗血栓因子、基因治療劑與反義藥物等。以核酸為基礎的基因藥物品種快速增加，正在進行臨床試驗的反義藥物已超過30種。近6年來批準的生物技術藥物數量是此前13年的3倍，最近4年批準的新藥總數是此前15年的總和。2000年批準了32個新藥，是1982—1993年11年的總和。1982~2000年共批準生物技術藥物175個，其中新藥116個，老藥新適應證59個。

在過去10年，生物技術新藥上市率一直居于新藥研究的榜首。20世紀90年代共批準 370個新藥，其中49個是生物技術藥物（占13％)。據EMEA統(tǒng)計，1995年有127個新化學實體藥物批準用于臨床，其中生物技術藥物為44種（占34％)。進行臨床試驗的生物技術藥物，在1988年為81種，1993年143種，1996年284種，到2000年已達369種。由此可見，生物技術藥物在未來醫(yī)藥工業(yè)經濟中占有重要地位。

1．生物技術藥物的發(fā)展已進入蛋白質工程藥物的新時期

第一代重組生物技術藥物逐步被第二代所取代，蛋白質工程技術日新月異，點突變技術、融合蛋白技術、定向進化、基因插入及基因打靶等技術使蛋白質工程藥物新品種迅速增加。

通過蛋白質工程手段可以提高重組蛋白的活性，改善制品的穩(wěn)定性，提高生物利用度，延長在體內的半衰期，降低制品的免疫原性等。如天然胰島素制劑在儲存中易形成二聚體和六聚體，延緩了胰島素從注射部位進入血液，從而延緩了降血糖作用，也增加了抗原性。這是胰島素B₂₃-B₂₈氨基酸殘基結構所致，改變這些殘基，則可降低聚合作用，使胰島素快速起作用。蛋白質工程技術在單抗人源化和制造融合蛋白方面也發(fā)揮了重大作用。當然蛋白質工程產品也有潛在缺點，如可能因結構與天然蛋白不同而增加免疫原性或降低了生物活性與治療價值或改變了藥效學和藥代動力學性質，因此臨床研究時，應特別仔細觀察。

2．新的高效表達系統(tǒng)的研究與應用

從基因工程藥物表達的研究策略看，迄今為止，已上市的生物技術藥物（DNA重組產品)多數是在E.coli表達系統(tǒng)生產的（34種)；其次是CHO細胞（14種)、幼倉鼠細胞（2種)以及釀酒酵母菌（11種)，正在進一步改進的重組表達系統(tǒng)有真菌、昆蟲細胞和轉基因植物和動物。轉基因動物作為新的表達體系之所以更令人關注是因為能更便宜地生產復雜產品。Genzyme，Transgenics(Framingham MA)，PPL theraputics(Edindurgh UK)和Pharming (Leiden,the Netherlands)等產品已進入臨床試驗(主要有α₁-抗胰蛋白酶，α-葡萄糖苷酶和抗凝血酶Ⅲ)，還有20種產品正在用轉基因山羊、綿羊或牛進行早期開發(fā)。實現用轉基因動物進行生物技術薊物生產，用于醫(yī)療已指日可待，通過克隆動物用于生物技術藥物生產也具有發(fā)展前景，如用克隆羊使其帶有人Ⅸ因子基因，用于制備IX因子。

3．將基因組和蛋白質研究成果轉化為生物技術新藥的研究與開發(fā)

蛋白質組學是研究細胞內全部蛋白質的表達方式和功能方式的學科。蛋白質組學研究的興起，標志著生命科學研究水平進入高通量和整體性研究結段，因為蛋白質具有自身的特殊活規(guī)律，如后修飾加工，轉運定位，結構形成，蛋白質與蛋白質之間、蛋白質與核酸的相互作用等。這些均不可能從細胞水平或基因水平上研究獲知。通過蛋白質組學研究，可以探索蛋白質在質量、功能、相互作用及關聯網絡系統(tǒng)的整體性、時控性和調控性，從而揭示機體的生理與病理過程，因此蛋白質組學的研究將為新藥的研發(fā)提供強大的物質基礎。 

蛋白質組學的研究內容包括：①發(fā)現疾病特異相關蛋白，如腫瘤相關標志蛋白，可用作腫瘤診斷和治療藥物的作用靶標。②研究不同個體、不同生理病理狀態(tài)下藥物代謝酶譜的變化，為藥代動力學和臨床提供專一依據，從而發(fā)展個性化用藥途徑。⑧研究藥物不良反應、毒副作用方面的蛋白質組學，為合理用藥提供依據，從而建立個體的蛋白質組數據庫，用于患者的蛋白質譜分類和執(zhí)行個性化用藥。④應用蛋白質組學技術，從傳統(tǒng)中藥中尋找天然活性物質，為實現中藥現代化提供生物技術手段，如對昆蟲毒素的系統(tǒng)活性分析，可以找到提供DNA重組生產的目的蛋白及其功能基因。

4．研究與開發(fā)生物技術薊物的新劑型

生物技術藥物多數易受胃酸及消化酶的降解破壞，其生物半衰期也普遍較短，需頻繁注射給藥，造成患者心理與身體的痛苦。即使皮下或肌內注射，其生物利用度也較低。另外多數多肽與蛋白質類藥物不易被親脂性膜所攝取，很難通過生物屏障。因此生物技術藥物的新劑型發(fā)展十分迅速，如對藥物進行化學修飾，制成前體藥物，應用吸收促進劑，添加酶抑制劑，增加藥物透皮吸收及設計各種給藥系統(tǒng)等。主要方向是研究開發(fā)方便合理的給藥途徑和新劑型：①埋植劑緩釋注射劑，尤其是納米粒給藥系統(tǒng)具有獨特的藥物保護作用和控釋特性。②非注射劑型，如呼吸道吸入、直腸給藥、鼻腔、口服和透皮給藥等。

（1)埋植劑  微型滲透泵埋植劑，其外形像膠囊的埋植劑，植入后，體液可透進外殼，溶解夾層電解質層，使夾層的體積膨脹，壓迫塑性內腔，使藥物從開口處定速釋出，已有肝素、胰島素和NGF等埋植劑在動物體內外的研究報道。

可注射的埋植劑，以生物降解聚合物作為埋植劑或注射型緩釋劑的骨架，常用的有2類：①天然聚合物，如明膠、葡聚糖、白蛋白、甲殼素等o②合成聚合物如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸翻羥乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚己內酯、聚羥丁酸等。其中PLGA在體內降解為乳酸、羥乙酸進一步分解為C0₂和H₂0具有良好生物相容性，無免疫原性，安全性高，并可通過聚合單體比例和聚合條件調節(jié)聚合物在體內的降解速度，其應用越來越廣泛。Zenica公司研制成功Zoladex注射型埋植劑，將多肽藥物戈舍瑞林(goserelin)與 PLGA熔融混合，經一多孔裝置擠出直徑為1mm和條狀物切成小段，單劑量3.6mg，滅菌后，密封于一次性注射器內待用�？晒┢は禄蚣∪鈨茸⑸溆�。

（2)微球注射劑  有多種注射型微球的制備方法，如相分離法、復乳-液中干燥法、噴霧干燥法、低溫噴霧提取法、熔融擠出法等。

四、國內臨床使用的主要生物技術藥物簡介

（一)乙型肝炎疫苗

乙型肝炎病毒(HBV)感染已是人類健康的嚴重威脅。據調查，我國國民中乙肝病毒攜帶者平均達到8.83％，全國約有一億以上人口為無癥狀乙肝病毒攜帶者；有乙肝病人約2700萬，每年發(fā)病人數在百萬以上。除因乙肝病毒感染導致慢性活動性肝炎和肝硬化等而引起死亡外，在肝癌患者中，約有80％是由乙肝病毒感染引起的。因此預防乙肝感染對我國來說，是關系子孫后代健康和振興中華大業(yè)的緊迫任務。根據現有的病毒攜帶率，預計從20世紀90年代初起，在疫苗目前已能保證充分供應的條件下，積極推行計劃免疫，進行母嬰阻斷接種，那么也要到21世紀中業(yè)才有可能使我國的病毒攜帶率降至現在的一半以下。由此可見，在我國，控制乙肝傳播須經過幾代人的努力，是一項非常嚴峻而艱巨的任務。

20世紀70年代初開始使用乙肝表面抗原(HBsAg)陽性血清制備乙肝疫苗預防乙肝病毒感染，開創(chuàng)了病毒尚不能在實驗室繁殖的情況下制備疫苗的先例。但這種血源疫苗存在一些問題，如血源有限、成本較高、帶有一定的潛在性危險等。特別是近年來艾滋病流行，血液制品易受HIV污染，致使乙肝血源疫苗的使用在一些國家受到限制。然而乙肝血源疫苗的生產和使用，說明HBsAg的主蛋白可以誘生良好的保護性抗體，使人免受 HBV的侵襲，這一事實為研制乙肝第二代疫苗奠定了良好基礎�；�因工程技術的飛速發(fā)展，使基因工程乙肝疫苗的研制成為可能。

（A)重組乙肝疫苗

20世紀80年代以來，國內外學者應用基因工程試圖制成乙肝疫苗，做了大量工作。比較成功的有以下幾條研制路線：①使用哺乳動物細胞表達HBsAg，大體上分為兩類：一是用SV40早期啟動子調控乙肝病毒表面抗原基因，以dhfr為擴增基因構建的質粒轉染CHO-dhfr-細胞，選出高產HbsAg的細胞系用于制備乙肝疫苗；二是用m-MT或h-MT為啟動子調控乙肝病毒表面抗原基因，以BPV為擴增基因構建的質粒轉化為小鼠乳瘤細胞C-127，選出高產HbsAg的細胞系，用其分泌的HbsAg純化后制備疫苗。這兩種方式分別在法國和美國研制成功。第一種方式在我國也研制成功，投入生產；②使用病毒載體組建重組病毒以表達HBsAg，用作活疫苗或滅活疫苗，如用痘苗病毒載體。我國組建了不經傳代細膩的重組病毒株VTH-2，它是以天然株為起始株的帶乙肝表面抗原主蛋白基因的毒株（adr亞型HBsAg基因)�，F已投入試生產；③使用重組酵母生產乙肝疫苗，即用DNA重組技術構建的重組酵母菌表達HBsAg，然后經過分離純化制成疫苗，我國已引進美國Merck公司的技術投入試生產。

[1]重組乙肝表面抗原疫苗（酵母)

簡稱“重組酵母乙肝疫苗（Recombinant HBsAg Vaccine（Yeast))。

1．結構與性質

HBsAg的基本結構是P24多肽鏈，它由226個氨基酸組成。以溴化氰裂解可產生5個肽段。其中80個氨基酸序列和位點已確認，與DNA序列編碼的氨基酸相符合。本品電泳結果只在分子量20000—25000之間有一條主帶，這條主帶有HBsAg特異性，且未糖基化，不存在HBsAg中P27糖基化帶。電鏡檢查結果表明本品的陽地與血源疫苗一樣，均為22nm的球形顆粒。

2．臨床應用

本品系由重組酵母合成的乙肝表面抗原經純化、滅活及吸附后制成，用于預防所有亞型的乙肝病毒感染，它與血源性乙肝疫苗具有同樣的效力和保護效果，但不含任何人血清成分，故更安全，更易為人們所接受。接種對象是乙肝易感者，包括嬰幼兒、兒童和因職業(yè)關系接觸乙肝病毒的成年人。但主要接種對象為嬰幼兒。接種對象應為乙肝病毒表面抗原陰性和轉氨酶正常者，接種于上臂三角肌內。接種程序和用量如表2-5。

表3-3  重組酵母乙肝疫苗接種程序和用量

接種重組酵母乙肝疫苗所產生的抗體與接種血源乙肝疫苗產生的抗體具有類似的免疫學性質和化學性質，這兩種乙肝疫苗在健康人群中產生相同的抗體譜，因而這兩種疫苗可以互換使用。使用血源性乙肝疫苗進行第一或第一、第二針免疫接種的人，可以用重組酵母疫苗完成第二、三針或第三針免疫接種，反之亦然。

已經患有肝炎、急性傳染病或其他嚴重疾病者禁用。對酵母或疫苗中任何成分過敏嚴、禁用。注射時應備有腎上腺素，當過敏反應發(fā)生時使用。每一接種對象必須使用單獨的注射器和注射針頭，以防止乙肝病毒和其他致病因子的相互傳染。用前搖勻，有搖不散塊狀物不得使用。

3．副作用

本品一般沒有嚴重的副反應，偶有注射部位紅腫或疼痛，發(fā)燒或頭痛。都為一過性反應。

[2]重組乙肝表面抗原疫苗(CHO細胞)

簡稱“乙肝基因疫苗”(recombinant HBsAg vaccine(CHO cell))。

1．結構與性質

乙肝病毒包膜蛋白的基因有三個基因序列，共用一個終止密碼，因而該基因的翻譯蛋白產物有三種：①HBsAg的主蛋白，有226個氨基酸；②中等蛋白，在主蛋白的N端，另有55個氨基酸；③大蛋白，含389—400個氨基酸。本晶主要是HBsAg的主蛋白，含226個氨基酸。電泳結果表明除有分子量為23000和27000兩條特異性蛋白區(qū)帶外，尚有三條糖蛋白區(qū)帶即GP30及其二聚體、多聚體，共五條區(qū)帶，都具有活性。

純化的HBsAg在CsCI中浮力密度為1.20～1.22，電鏡檢查HBsAg顆粒是均勻的，有時存在少數大或小的空心顆粒。5+端氨基酸序列分析結果與編碼堿基序列完全相符。

2．臨床應用

本品用于預防乙型肝炎。接種對象是乙型肝炎易感者(表面抗原陰性、轉氨酶正常)，主要用于嬰幼兒。一般易感者(嬰兒、兒童和成人)每次注射lml(10μg)，免疫間隔為零月(注射當時)、一月、六月共三針。三針后1個月100％抗體陽轉。用于高危病人如腎透析病人及其他與乙肝密切接觸者，可用20μg／lml劑型。用于母體HBsAg陽性(特別是e抗原陽性)的新生兒，應在出生后48h內注射，用20μg／lml劑型。注射間隔同上，亦可與乙肝高價免疫球蛋白(HBIG)聯合使用。

本品注射時要充分搖均，注射部位為上臂三角肌內。對患有肝炎、發(fā)熱、急性慢性嚴重疾病或有過敏史者禁用本品。如有安瓿破裂、變質或有搖不散的塊狀物不得使用。本品貯存過程中嚴防凍結。

（B)新型乙型肝炎疫苗

20世紀80年代早期開始的乙型肝炎(HB)疫苗接種無疑取得了巨大成功，在廣泛使用陽疫苗的人群中，HB發(fā)病率顯著下降，近十幾年來，已證明HB疫苗安全有效，共有高度免疫原性，90％以上的接種者達到保護性抗-HBs水平，所有成功接種者(抗-HBs水平>10U／L)都能抵抗HB。并且該疫苗耐受性良好，從未觀察到明顯由該疫苗引起的嚴重不良反應。

然而，HB疫苗的一些缺點阻礙了它的應用。全程免疫需接種3次疫苗，這會降低免覆蓋率；1％～10％的健康者對疫苗應答不佳，該百分率在老年人中保持恒定；另外，伺可能逃避現有疫苗保護作用的HBsAg突變株存在爭論。鑒于這些原因，目前正在研制新的更好的HB疫苗，以增強疫苗的免疫原性，簡化HB疫苗接種。

[1]改進現有疫苗的方法

1．聯合疫苗

HB疫苗可與其他疫苗（尤其是兒童期疫苗)聯合使用，這樣只需一針注射，其結果無疑會提高疫覆蓋率。HB與DTP或甲型肝炎與乙型流感桿菌（Hib)聯合疫苗已有一些國家應用，目前正在開發(fā)DTP、HB、脊髓灰質炎和Hib聯合疫苗。

2．單劑疫苗

人們正在用控釋微粒技術研制單劑疫苗。該法是利用滅活疫苗一針注射誘導強的長期免疫應答。將疫苗包裹于無反應性且能很好耐受的可生物降解聚合物(聚丙交酯—聚乙交酯)中。疫苗依其在這些微球內的分布于不同時間點釋放出不同的量，這樣可模擬不同時間間隔接種數劑疫苗。動物實驗已獲成功：1劑含HBsAg的微粒誘導的免疫應答幾乎與不同時間接種3劑的常規(guī)HB疫苗相同。

3．口服疫苗

含HBsAg編碼基因的重組沙門菌實驗疫苗可在小鼠中誘導抗—HBs應答。今后的方法是研制表達HBsAg的轉基因植物(如香蕉等)作為可食用疫苗。

[2]增強HB疫苗免疫原性的方法

1．新遞釋系統(tǒng)

目前正在對幾種增強HB疫苗免疫原性的方法進行研究。第一種是使用替代的遞釋系統(tǒng)：正在對新佐劑進行檢測，痘苗、腺病毒或沙門菌等重組微生物正在被用作感染后的表達宿主，并誘導其特異性免疫力。

2．新佐劑

為增強免疫缺陷者(如血液透析病人)的免疫應答，用Q或了干擾素作為常規(guī)疫苗的佐劑已取得一定成功。Meuer等將白細胞介素—2與疫苗一起注射的預試研究已取得較好結果。然而，Jungers的大規(guī)模對照研究不能證實這些結果。實驗性新佐劑單磷酸脂質A的臨床試驗結果比常規(guī)疫苗略好。

3．重組活載體

迄今，對重組活載體只進行過動物實驗。Moss等對含HBsAg基因的重組痘苗病毒的試驗表明，該疫苗能保護黑猩猩抵抗HB病毒的攻擊。然而，痘苗病毒副作用大，不能用于人類。

（二)干擾素

A．干擾素的定義

1980年國際干擾素命名委員會正確定名為interferon，簡寫為IFN，定義如下：干擾素是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，其活性的發(fā)揮又受細胞基因組的調節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質的合成。

目前認為，干擾素是一種類似多肽激素的細胞功能調節(jié)劑，是一種細胞素，其含義如下：

第一，干擾素必須是一種蛋白質，它對蛋白酶類是敏感的，而對DNA酶或RNA酶卻有抵抗能力。天然干擾素是一種糖蛋白，采用DNA重組技術由大腸桿菌表達的人干擾素多肽不帶糖分子。

第二，這種蛋白質的結構基因與調節(jié)基因廣泛地存在于脊椎動物或更高等動物的細胞內。在一般生理狀態(tài)下，細胞的干擾素基因呈靜止狀態(tài)，只有在特定誘生劑的作用下。細胞的干擾素基因才活動轉錄合成相應的mRNA，進而轉譯出具有種屬特異性的干擾素蛋白。

第三，干擾素本身并不能直接滅活病毒，干擾素作用于細胞后，使后者又產生多種其他蛋白質(抗病毒蛋白)，從而阻斷病毒的繁殖。

第四，干擾素必須具有廣譜的抗病毒活性。如果某一種抗病毒物質僅對特定的病毒有作用，就不能稱為干擾素。

B．干擾素的種類和命名

干擾素在生物界的分布是很廣泛的，不僅人和高等動物的有關細胞能產生干擾素，而且許多低等動物、昆蟲、植物和細胞也能產生干擾素，概括起來可以分為人干擾素、動物干擾素、昆蟲干擾素、植物干擾素和細胞干擾素五大類。國際上對人和鼠干擾素提出了一種新的命名法，根據抗原特異性和分子結構的不同分為α、β、γ三型，在命名法中還規(guī)定：①若今后繼續(xù)發(fā)現新干擾素，則在IFN右側標以δ、ε等即可；②若要表示IFN的來源，則在IFN左側標明種或屬的縮寫或全名即可，如HulFN(人干擾素)、MulFN(鼠干擾素)、BovlFN(牛干擾素)；③若要區(qū)別不同細胞產生的同一型干擾素，則可在該型干擾素縮寫名稱的右側括弧內標以細胞名的縮寫即可，如HulFN-α(Le)為α-人白細胞干擾素、HuIFN-α(Ly)為α-人淋巴細胞干擾素；④若在今后發(fā)現某些類型的干擾素在其蛋白質多肽鏈上的氨基酸排列順序有差異，則還可再分亞型，如HuIFN-α1，HuIFN-β2；⑤若要表示分子量的不同，則可將分子量標在其縮寫名右側括弧內，如HuIFN-α(18000)，HulFN-β(38000)等。

近年來隨著基因工程技術的發(fā)展，基因工程干擾素研制成功，為了區(qū)分基因工程干擾素和自然干擾素，則分別以rlFN和nlFN表示。

C．干擾素的基本特性及其作用特點

干擾素的基本特性主要有以下幾點：

（1)種屬特異性  即所有的干擾素，都有較嚴格的種屬特異性，所謂“種屬特異性”即指某一種屬的細胞所產生干擾素只能作用于相同種屬的其他細胞，使其獲得“免疫力”。例如人干擾素只對人體有保護作用，而對其他動物就沒有保護作用。但也有例外，如猴干擾素除對猴有保護作用外，對人亦有一定的保護作用。

（2)作用廣譜性和選擇性  廣譜性即指干擾素作用于機體有關細胞后，可使其獲得抗多種病毒和其他微生物的能力。選擇性即指干擾素僅作用于異常細胞，對正常細胞的作用很小。

（3)相對無害性  干擾素已廣泛應用于臨床，但到目前為止還未發(fā)現它對人體有什么嚴重的副作用，在臨床應用干擾素治療時即使有時會出現些不良反應，但一經停藥后，即可迅速恢復正常，均屬可逆反應。

（4)特殊穩(wěn)定性  α、β干擾素一般在60℃條件下放置1h也不會被滅活，γ干擾素可于56℃被滅活，純晶可在低溫下(—20℃以下)長期保存，若加入適量的人血白蛋白等穩(wěn)定劑，則效果更好。

α、β干擾素對酸性pH相當穩(wěn)定，γ干擾素在pH為2的情況下不穩(wěn)定。

D．干擾素的生物活性

1．抑制病毒繁殖活性

干擾素具有廣譜抗病毒活性，它在同種細胞或機體內，對多種病毒包括DNA病毒、RNA病毒、引起腫瘤的病毒或不引起腫瘤的病毒都有一定程度的抑制作用，但是抑制程度卻因病毒種類而千差萬別，甚至同一病毒的不同血清型對干擾素的敏感性差別也很大。干擾素的抗病毒作用，并不是靠干擾素本身去直接“中和”或“抑殺”病毒，而是間接地通過細胞產生“抗病毒蛋白”發(fā)揮作用的。干擾素的抗病毒活性有相對的種屬特異性。

干擾素的抗病毒作用表現為病毒繁殖量的減少，以及由此而引起的細胞損傷的減少。干擾素可以阻斷病毒顆粒的復制，減少病毒數量，使顯性感染變成不顯性感染，對一般病毒感染可以促進機體恢復，縮短病程。

2．抑制細胞分裂活性

干擾素在試管內和在機體內對細胞生長有抑制作用，產生這一作用的干擾素量要比抑制水泡性口炎病毒(VSV)繁殖的有效劑量大30倍，對生長快的細胞遠比對生長慢的抑制作用要強。干擾素對迅速分裂的腫瘤細胞有選擇性的抑制作用，這對防治腫瘤有十定意義。

干擾素的抑制細胞分裂活性也有相對的種屬特異性。

干擾素抗腫瘤作用的機制并不是單一的，是綜合性的，據目前所知，除干擾素直接抑制腫瘤細胞的生長外，還有抑制腫瘤病毒的繁殖和調動機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞，促進巨噬細胞的吞噬，引起腫瘤細胞迅速被破壞減少的功能。干擾素可以抑制抗抗體反應，從而可能降低腫瘤保護抗體的水平，使免疫系統(tǒng)更有效地作用于腫瘤。干擾素可以改變腫瘤細胞的細胞膜，以增加腫瘤特異性組織相容性抗原的表達，以利于殺傷清除腫瘤細胞。干擾素可增進NK細胞活力，這一點可能是干擾素抗腫瘤作用的最為重要的一個原因。

3．免疫調節(jié)活性

(1)免疫系統(tǒng)細胞產生干擾素

免疫系統(tǒng)細胞產生干擾素的主要類型是γ亞型以及酸不穩(wěn)定性α亞型，也有少量的α亞型或β亞型。詳見表3-4。

表3-4  免疫系統(tǒng)細胞所產生的干擾素

（2)干擾素對效應細胞的影響

①增強組織相容性抗原和某些受體的表達。一定濃度的干擾素可增強淋巴細胞表面組織相容性抗原、β-2微球蛋白及IgG、Fc受體的表達，從而調節(jié)許多免疫反應，包括免疫復合物的清除，吞噬作用和依賴抗體的細胞毒作用。干擾素對巨噬細胞的功能有增進作用，并可調節(jié)T、B細胞功能。

②干擾素可增加NK細胞的活性，α、β、γ干擾素均能刺激NK細胞對腫瘤細胞系和新分離的腫瘤細胞的細胞毒作用，而有效地保護正常細胞免受NK細胞的殺傷。干擾素增加NK細胞活性包括兩個方面，一是激活NK細胞前體，二是增加被溶解的細胞譜。

③干擾素與其他細胞因子關系也相當密切。外周血單核細胞在有絲分裂素刺激下，不僅可以誘生γ干擾素，同時產生其他細胞因子，如白細胞介素-2(重L-2)、淋巴毒素(LT)等。目前所知，IL-2參與IFN-γ產生的調節(jié)機制，而IFN對激活的T細胞產生IL-2也是必需的。部分純化的IFN-γ可以增加IL-2受體，而T細胞的增殖是依賴于IL-2受體的表達和密度的。純化的IL-2可以增加有絲分裂素刺激淋巴細胞誘生IFN-γ，這說明IFN-γ與IL-2在功能上是緊密聯系的。干擾素對免疫功能的調節(jié)作用歸納于表3-5。

表3-5  干擾素的免疫調節(jié)活性

干擾素的生物功能本質歸納為圖3-1。

E．干擾素的臨床應用

a.干擾素的臨床適應證

1．急性病毒性感染

（1)常見多發(fā)病  流感及其他上呼吸道病毒性疾病、流行性結膜炎、病毒性角膜炎、病毒性流行性腹瀉、病毒性心肌炎、單純皰疹感染、水痘、帶狀皰疹、流行性腮腺炎等。

（2)死亡率高的病毒病  乙型腦炎、狂犬病、小兒病毒性肺炎等。

2．慢性病毒性感染

這類疾病可能是由于干擾素系統(tǒng)功能損害所致，包括慢性活動性肝炎、巨細胞病毒性感染。

3．惡性腫瘤

（1)去除原始腫瘤后，進行防止轉移的預防性治療，如成骨肉瘤等。

（2)對用病毒學或免疫學方法早期診斷的腫瘤，在臨床癥狀出現以前進行早期治療，如鼻咽癌、原發(fā)性肝癌。

（3)各期惡性腫瘤

4．器官移植患者

由于器官移植患者使用免疫抑制藥物，所以易患病毒性感染，使用干擾素可以防止病毒感染和抑制對同種異體移植物的排斥。

b.干擾素的生物活性對防治病毒性疾病和惡性腫瘤的作用

干擾素防治病毒性疾病的作用見表3-6。干擾素治療病毒性和其他非腫瘤疾病的療效見表3-7。干擾素的生物活性對治療惡性腫瘤的作用見表3-8，對治療腫瘤的療效見表3-9。

表3-6  干擾素對防治病毒笥疾病的作用

表3-7  干擾素治療病毒性和其他非腫瘤疾病的療效

表3-8  干擾素對治療腫瘤的作用

表3-9  干擾素治療腫瘤的療效

F．目前臨床上使用的各種類型干擾素

a.人干擾素α1b（humanreconbinant interferon α1b)

1．簡稱

rHu IFN α1b

2．商品名

Referon、干擾素、悅復能。

3．結構與性質

本品是由166個氨基酸殘基組成的多肽，內含5個Cys，形成二條二硫鍵，Cys空位的存在易使二硫鍵錯配，形成聚合體，聚合體的活性僅為單體的十分之一。

本品分子量理論值19392，等電點在5~6之間有多條導電聚焦電泳帶，說明其等電點的不均一性。對酸十分穩(wěn)定，在pH2的溶液中亦不會失活，利用這一性質有利于純化。對各種蛋白酶十分敏感，很易失去活性。

4．臨床應用

(1)本品具有廣譜的抗病毒作用，目前用于治療乙型和丙型肝炎、治療乙型肝炎具體方法如下：

甲組：400萬U/次，肌內注射，·每日一次，連用3個月。

乙組：400萬U/次，肌內注射，每日一次，連用一個月后改為400萬U/次，隔日一次，連用2個月。

全部病例治療前及治療后每月檢測一次：血清I-IgsAg、BeAg、抗Hge、HBV-DNA。治療前及治療開始后每2周檢測1次肝功能、血常規(guī)、血小板、尿常規(guī)、尿素氮等指標。

肝功能：甲組26例治療前血清ALT異常者，治療后14例復常(53.85％)，乙組19例治療前血清ALT異常者治療后7例復常(36.84％)，兩組復常率經統(tǒng)計學處理無顯著性差異(P>0.05)。

結果表明：兩組HBsAg、HBV-DNA陰轉率無顯著性差異。而HBsAg陰轉率兩組存在顯著性差異。(P<0.05)。

干擾素αlb已大規(guī)模用于，臨床，但其劑量仍在探討中。上述兩組劑量均取得一定療效。但HBsAg陰轉率兩組存在顯著性差異，甲組優(yōu)于乙組。這與國外學者主張的大劑量連續(xù)使用是一致的。

本品的副作用為低熱、皮疹等，其副作用顯著低于進口干擾素。但療效與進口干擾素相似。

治療丙型肝炎的方法與乙型肝炎相似，但以大劑量即每天注射400萬U以上連續(xù)3個月~6個月療效較好。經干擾素αlbl2周治療后，有50％的丙型肝炎病人ALT恢復到正常水平，這一療效是其他任何藥物所不及的，所以目前干擾素是治療丙肝的首選藥物。

(2)本品用于治療毛細胞白血病11例，每天注射60μg，連續(xù)2至6個月，總有效率為63．4％，低于國外報道的有效率80％�？赡芘c所用劑量低和延續(xù)時間(應為12個月)短有關。

(3)本品還可用于治療皰疹、宮頸炎、結膜炎、尖銳濕疣等。局部應用，療效顯著。

(4)規(guī)格：lO μg、20 μg、30 μg三種凍干粉針。

(5)貯藏：4~8℃冰箱，避光貯存。

b.人干擾素α2a(humanrecombinantinterferonα2a)

1．簡稱

rHulFN α2a。

2．商品名

羅擾素、抗病肽、因特芬、Roferon-A。

3．結構與性質 ．

本品是由165個氨基酸組成的單鏈多肽，Cysl和Cys98、Cys29和Cysl38組成兩條二硫鍵。其中29~138之間的二硫鍵對干擾素生物活性更為重要。在pH2.5的溶液中穩(wěn)定，對熱也穩(wěn)定。對各種蛋白酶敏感。分子量理論值為19219，等電點在5~6之間。分子中無糖。比活性達2×108U/mg蛋白。

4．臨床應用

本品具有很多天然的人類Q干擾素制劑的特性。體外試驗表明，對不同人體腫瘤有抗增生作用，對裸鼠之人體腫瘤移植有抑制作用。這種作用已在毛細胞白血病和卡波濟肉瘤患者中獲得證實。毛細胞白血病一般劑量為每天300萬U，持續(xù)16~24周。維持劑量為300萬一500萬U，每周三次，肌注或皮下注射。卡波濟肉瘤一般劑量為首3天每天300萬U，第4~6天每天900萬U，然后增至可耐受的最高劑量，每周3次，肌注或皮下注射，可用藥至腫瘤完全消失。

本品與細胞表面的特殊受體結合后，刺激細胞產生2’，5’-寡腺苷酸合成酶、dsRNA-dependent蛋白激酶、Mx蛋白等。這些產物會抑制病毒蛋白質合成，抑制病毒核酸的轉錄和分解病毒的RNA核酸。另外本品可以調節(jié)免疫力，可以影響細胞膜表面抗原的表達，也可以影響很多免疫中間物質的細胞膜受體表達，此外還可以影響細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞及B細胞作用。以上這些作用可用于治療乙型和丙型肝炎，一般劑量為300萬U，每周三次，皮下注射，如在3~4月后病情未獲改善，可考慮停藥。

本品用于治療慢性乙型肝炎(CHB)已有多年的歷史。CHB患者由于乙肝病毒(HBV)持續(xù)存在，致使機體細胞和體液免疫功能紊亂，造成肝細胞的免疫損傷和肝臟慢性活動性炎癥，IFN-α具有抗病毒和調節(jié)免疫功能的雙重作用，用于治療CHB可獲得50％左右的長期療效。

IFN-α的抗病毒作用并不是直接作用于病毒，而是通過誘導感染HBV的細胞產生一類蛋白質發(fā)揮效能。這些蛋白質又稱抗病毒蛋白(AVP)。AVP主要有3種：①蛋白激酶：可使分子量67000和35000兩種多肽發(fā)生磷酸化，其中35000多肽是合成多肽的啟動因子，經磷酸化失活后，導致病毒合成的抑制；②2’，5’-寡腺苷酸合成酶：能在雙股RNA作用卞，使ATP聚合成寡腺苷酸，激活細胞內的核苷酸酶F，使mRNA降解，從而阻斷病毒蛋白的合成；③磷酸二酯酶：能降解2’，5’-寡腺苷酸，還能去除tRNA的pCpCpA末端，抑制病毒蛋白的翻譯，從而達到抗HBV的作用。

IFN-α對HBV的作用只限于復制型由HBV-DNA，并不能清除細胞核內的車制模板cccDNA，亦不能清除已與宿主DNA整合的病毒基因，故難以使其表達的HBsAg消失。同時，它只是在HBV大量復制，并引起細胞炎癥應答時才發(fā)揮其最大抑制效應。

IFN-α還具有抗細胞分裂活性及免疫調節(jié)活性，它通過調節(jié)細胞免疫、體液免疫來調節(jié)機體的防御功能，它還可以增強肝細胞膜上的HLA-1類的抗原表達，使TC增強識別HBV感染的肝細胞并破壞它。IFN-α還可抑制有絲分裂原，促使T細胞增殖，還可增強巨噬細胞活性，并通過調節(jié)K細胞和NK細胞活性來調節(jié)機體免疫監(jiān)視功能。

當IFN-α治療CHB開始后，其血清中HBV-DNA水平很快下降，是其直接抗病毒作用的結果。療程第6~8周時部分病人ALT升高，則可能是IFN-α激活了宿主的免疫應答，破壞了感染HBV的肝細胞所致。由于IFN-α抑制了HBV的復制，減少了靶抗原的產生，IFN-α又同時激發(fā)了宿主的免疫反應，清除了HBV，從而緩解了肝臟炎癥的活動，使ALT下降。

(1)治療病例的選擇 目前尚無準確方法判定IFN-α對于哪些CHB治療有效，哪些患者治療后不復發(fā)，IFN-α對哪些病人治療有害無益，因而選擇用IFN-α治療的病例應謹慎。因為IFN-α對于HBV的作用，只限于復制型的HBV-DNA，當病毒復制導致肝臟炎癥應答時，IFN-α才產生抗病毒和免設調節(jié)效應，所以一般認為輕癥、早期或非活動性CHB患者，暫不宜使用IFN-α。對失代償的乙型肝炎肝硬化或中度以上黃疸的CHB，雖然血清中HBV-DNA陽性，但IFN-α可使肝小葉炎癥激活或炎癥加重，不易為衰竭的肝臟所耐受，往往導致病情加重或死亡，所以不宜用IFN-α治療。另外，當發(fā)生自身免疫性肝病時，肝炎病毒血清標志物可出現假陽性，此時若予IFN-α治療則往往使病情加重，故應注意鑒別。

CHB選擇IFN-α治療的依據：①ALT中度升高；②血清HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性；③血清HBV-DNA陽性；④血清高滴度HbcAb-IgM；⑤肝組織病理檢查為慢性活動型肝炎；⑥或伴有血清抗HDV-IgM陽性；⑦或伴血清抗HCV-IgM、HVC-RNA陽性。

(2)劑量和療程 經前瞻性對照研究，用IFN-α 100萬U、300萬U、500萬U、1000萬U皮下或肌肉注射，隔日一次或每周3次，療程3~6月。相比之下，1000萬U有最高的反應(血清HBV-DNA、HbeAg消失)、隨后臨床癥狀及血清生化指標緩解，肝臟活動性炎癥緩解，但不能耐受的病例增多。而100萬U效果最差，有效病例很少，所以不宜推廣。療程16周與24周效果相似，后者復發(fā)略為減少。因此，IFN-α治療CHB的最低劑量是300萬U，肌肉注射隔日一次或每周3次，最適宜的劑量是500萬U肌肉注射，隔日二次或每周3次，療程不少于16周。

(3)療效和復發(fā) CHB經IFN-α 300萬U肌注，隔日一次或每周3次治療3~4個月后，約有50％病人可獲完全效應。表現為HBV-DNA消失、HBsAg陰轉、ALT穩(wěn)定正常、肝小葉炎癥和碎屑樣壞死減輕。隨訪5~7年，患者病情大多穩(wěn)定。其HBV-DNA消失時間多在5個月之內，HBeAg多在10個月內清除。ALT恢復穩(wěn)定正常多在13個月以內，可有50％左右HBeAb陽轉。而HBeAg被清除者僅占15％~20％。且多在治療后1~2年，這多見于感染時間較短和年齡較大的病人。

CHB病人經IFN-α治療后，即使獲得完全效應者，亦不等于HBV被完全清除，其中仍有10％~20％病例在1~2年內感染再活動。復發(fā)表現是ALT升高、HBV-DNA陽轉，或HBeAb逆轉為HBeAg。其主要原因是CHB病人經IFN-α治療后，HBV以低水平保留在肝內或外周單核細胞中，因自發(fā)或免疫抑制或使用細胞毒藥物，或因其他病毒感染 (如HIV、流感等)的激發(fā)而再活動。其次是由于HBV變異(主要是前C_A83變異株)。其特點是HBV-DNA和HBeAb同時存在。對復發(fā)病例應首先排除病毒的重疊感染后，再考慮是否因IFN-α治療不充分引起。如重復使用IFN-α治療CHB，對復發(fā)病例一般仍有良好效果。

(4)IFN-α治療CHB療效預測因素

CHB臨床表現形式很多，HBV血清標志物表現亦不盡相同，加之IFN-α價格昂貴，療效亦僅50％左右，遠期復發(fā)率仍高，且有一定的非適應證，所以不是所有CHB病人均為IFN-α的治療對象。根據近期多種報道，下列諸條可作為IFN-α治療CHB療效預測因素：①CHB病活動期者效果好(表現為ALT高值，HbcAb-IgM陽性，肝組織活檢肝小葉內炎癥浸潤和伴有碎屑樣壞死)；②血清HBV-DNA水平低者效果好(>200pg／ml者多難奏效)；③病程短于4年或伴有急性黃疸型肝炎病史者效果好；④IFN-α治療后，血清與外周單核細胞2’，5’-寡腺苷酸合成酶增多10倍以上者效果好；⑤血清β2-微球蛋白(膽MG)在IFN-α治療2周后迅速升高(>226mg／L)者效果好；⑥T4／T8比值在IFN-α治療后顯著升高者效果好；⑦成人無其他合并癥者效果好；⑧IFN-α在療程中，早期出現干擾素抗體者效果差；⑨HBV垂直感染、嬰幼兒時期感染者、男性、同性戀者效果差。

IFN-α治療慢性HBV感染，目前雖被推薦為首選藥物，但其抗病毒效果仍欠理想，且影響IFN-α療效的因素眾多，所以必須嚴格選擇病例，熟悉IFN-α性能，合理地確定使用劑量和療程，注意藥物的副作用，留取IFN-α治療病例前、中、后血清進行HBV標志物及復制水平的監(jiān)測和IFN-α抗體檢查，及時調整IFNα的劑量或類型，才能更好地提高治療效果。

使用本品的初期，可能會有幾天的頭痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、乏力、倦怠、肌痛、食欲減退等流感樣癥狀。在臨睡前注射會更容易適應這些癥狀所引起的不適。使用本晶偶有白細胞減少或血小板減少的現象，則要非常小心地處理，要定期做這兩項指標的檢驗，一般而言，在停藥后即會恢復正常。

下列病人禁止使用本晶：①已知對藥物或其他干擾素有過敏史；②患有嚴重的心臟疾��；③患有嚴重的肝腎疾病；④有癲癇和中樞神系統(tǒng)功能不佳；⑤孕婦。

5．規(guī)格

1×10⁶,3×10⁶,5×10⁶U三種規(guī)格，均為凍干粉針劑，用時加1 ml注射用水。

6．貯藏

貯于2~8℃，本藥不含防腐劑，故應避免污染，每瓶藥物只供一次取用。

C．人干擾素α2a(humanreconbinant interferon α2b)

1.簡稱

rHuIFNα2b

2.商品名

InteronA，干擾能。

3．結構與性質

本品是申165個氨基酸殘基組成的多肽。它與rHuIFNα2a在結構上僅差一個氨基酸，即在第23位不是Lys而是Arg，其余結構均相同，因此，性質也基本相同。

4．臨床應用

本品在臨床前期用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)及動物體內人體腫瘤異種移植之研究表明具有抗增生作用，在體外試驗亦表明有明顯的免疫調節(jié)活性。此免疫調節(jié)活性可增強巨噬細胞的吞噬作用，同時增強淋巴細胞對靶細胞的特殊細胞毒性，這些作用可用于治療多發(fā)性骨髓瘤、卡波濟肉瘤、惡性黑色素瘤、毛細胞白血病及喉乳頭狀瘤。使用劑量為300萬U~500萬U，隔日皮下注射一次。療程根據相病種而異，卡波濟肉瘤5天為一療程，其他病需一個月到三個月不等。若有不良反應發(fā)生，應調整劑量或暫停用藥。若病人不能耐受或病情惡化，則停用本品。

本品與細胞膜上特殊受體結合后，能發(fā)揮細胞活性，誘導某些酶的作用，阻止受病毒感染細胞中病毒復制與增殖，起到抗病毒活性，用于治療慢性乙型肝炎、丙型肝炎等。每日劑量300萬U，持續(xù)一個月，然后隔日皮下注射100萬U~300萬U，至3個月到半年。劑量和療程視病人耐受情況而調整，若發(fā)生嚴重不良反應應停止用藥。

本品副作用輕微且具可逆性，若與放射療法或其他抗癌藥共用，可起協同作用。對乙型肝炎的治療，一般在先服用潑尼松等激素治療一個月后，再注射本品療效更佳。為了緩解因用本品引起的發(fā)燒及頭痛癥狀，可在注射本品前30min服用對乙酰氨基酚500mg。

本品不良反應除發(fā)燒、頭痛外，還包括寒戰(zhàn)、食欲缺乏、惡心、腹瀉、背痛、嗜睡、低血壓等。這些反應是可逆的，一般在停藥72h后消失，且反應的輕重與用藥劑量有關。

本品不能用于心腦血管病人，如有心肌梗死史和心律不齊的病人，孕婦禁用。

5．規(guī)格

1×10⁶, 3×10⁶兩種規(guī)格，均為凍干粉劑。

6．貯藏

貯存于4~8℃冰箱。

d．人干擾素γ(human recombinant interferon γ)

1．簡稱

rHuIFNγ

2．結構與性質

本品含有23個氨基酸殘基的信號肽，由143個氨基酸組成，分子量為16775，在氨基酸水平上與干擾素α和β 99％差異，且在分子中無Cys，故無二硫鍵，因此本品的性質與干擾素α和β差異也很大，對酸很不穩(wěn)定，對熱穩(wěn)定性也很差。由于結構中堿性氨基酸占多數，故其等電點偏堿性，約為pH 8.6以上。分子中分為兩個片段：氨基端片段與羥基片段，這種結構與其活性有密切的關系。此外，本晶的C端是不齊的，可被蛋白水解酶在Arg，Lys及其他氨基酸的地方多處水解，形成不同長度的分子，但它們大多數都有活力。

天然γ干擾素是一種糖蛋白，它在第25位和97位Asn處有兩個N糖基化位點，而大腸桿菌表達γ干擾素無糖基化，但研究證實仍具有生物學活性。

3．臨床應用

本品除有抗病毒和抑制細胞生長活性外，主要是對免疫系統(tǒng)的作用，它的免疫調節(jié)功能包括激活巨噬細胞，促進各種免疫細胞的成熟與淋巴因子的分泌，誘導I、II型MHC基因的表達等，尤其是近年來發(fā)現γ干擾素對類風濕性關節(jié)炎療效甚佳，更擴展了本品的臨床應用前景。目前進行臨床應用的適應證有宮頸瘤、生殖器疣、慢性肉芽腫和病毒感染及其他某些腫瘤。

本品用作皮下或肌內注射，生殖器疣亦可采用病灶基部注射，一般用量為10⁶U／日，療程視不同疾病由醫(yī)師決定。常見的副反應為發(fā)熱和疲勞感，其他如厭食、局部疼痛等，副反應均為一過性和可逆性。治療期間觀察白細胞計數、肝功能變化。凡有明顯過敏體質、特別是對抗生素有過敏史者，應慎用，必須使用時應先用本晶做皮膚試驗，陰性者可使用。嚴重心臟病或腎臟病患者、癲癇和其他中樞神經系統(tǒng)功能紊亂者及孕婦嚴禁使用本品。安瓿有裂縫、破損不能使用，如有搖不散塊狀物或絮狀物均不得應用。

4．規(guī)格

1×10⁶在一種規(guī)格。

5．貯藏

2~8℃暗處保存。

G、干擾素的藥理作用及臨床應用的研究發(fā)展

（a)干擾素受體的研究

干擾素受體的存在，是干擾素通過細胞發(fā)揮其生物學功能的一個重要條件。目前所知，根據抗原性將干擾素分為α、β、γ三型。干擾素的受體主要存在于細胞膜，受體對干擾素的結合，也有高嗜性和低嗜性之分，其只有與靶細胞上的高親和力受體特異結合才發(fā)揮生物學效應。干擾素激活細胞的機理主要是通過與細胞膜受體結合引起干擾素基因激活因子活化，啟動于干擾素激活基因轉錄，合成一些具有特殊功能的蛋白質，從而發(fā)揮效應作用。

近年來研制成功高度親和性的人IFN-γ受體特異性單抗，與毒素、放射性同位素、化療藥物聯結后可作用于相應的腫瘤細胞，使之與受體結合，從而殺傷或抑制腫瘤細胞。預計此種導向療法可應用于治療某些腫瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反應等。

關于干擾素對細胞受體的調節(jié)，尤其是IFN-γ對TNF以及LT和IL-2受體的表達都有正調節(jié)作用，因此在臨床試治研究中，越來越重視多種細胞因子的協同應用。

（b)干擾素的臨床應用研究

干擾素的研究可以大體分為下面幾個階段：①1957年人類發(fā)現干擾素；②20世紀60年代尋找到新城雞疫病毒(NDV)和仙臺病毒等高效干擾素誘生劑；③20世紀70年代研制成功人白細胞干擾素、人成纖維細胞干擾素和人類淋巴細胞干擾素，不僅可以批量生產而且可應用于臨床，被認為是當代抗病毒、抗腫瘤的一種最有希望的治療制劑，受到臨床界的重視；④20世紀80年代基因工程干擾素研制成功，僅就α干擾素而言，就有四十多個國家應用，被批準治療的病種達二十多種，像對人類危害比較大的疾病如：慢性活動性肝炎、丙肝、丁肝、毛細胞白血病、慢性髓細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等疾病，都獲得較滿意療效。

目前對于擾素的應用研究包括以下方面：

1．干擾素基因療法

如將IFN-γ基因轉移人細胞毒性T淋巴細胞(CTL)中，并證明此種CTL的抗腫瘤作用顯著強于常規(guī)CTL。

2．人工新型干擾素的研究

（1)抗病毒活性增強的新型IFNs  例如用點突變技術將重組IFN-β第17位氨基酸殘基上的游離Cys換為Ser，結果IFN-β Serl7的抗病毒活性比重組IFN-β高10倍。新型人IFN-γ也有類似特性，抗病毒活性比原人IFN-γ提高4~50倍。

（2)穩(wěn)定性增加的新型IFNs  最典型的例子是IFN-β Serl7，與nIFN-β相比，其穩(wěn)定性明顯增加。NIFN-β，在-70℃保存75d抗病毒活性大量喪失，而IFN-β Serl7在同樣條件下貯存150d，其抗病毒活性沒有改變。新研制的rIFN經50℃處理，其活性喪失極小，可保持原來活性的81％~98％。

（3)調節(jié)NK細胞活性增強的新型IFNs 最令人鼓舞的是IFN-αD新型雜合體對鼠NK細胞活性的調節(jié)作用比親本IFN提高了10~400倍。

（4)抗原性改變的新型IFNs  大多數IFNs類似物和雜合體都具有與親本IFN相同的抗原性，然而，若IFN-β₁ 141位上的Cys被Tyr取代，不能形成二硫鍵時，這種新型干擾素的抗原性發(fā)生改變，就不再與自然IFN-β1競爭抗體。

（5)種屬特異性改變的新型IFNs  對新構建的IFN-αA和D雜合體研究時發(fā)現，IFN-αD在牛MDBK細胞中相對活性最高；IFN-αA在人MG2767細胞系中相對活性最高，而它們的雜合體IFN-α₂(B) α₁(1FN-αAD)則在鼠L929細胞中相對活性最高，完全不同于兩個親本。

3．關于用藥策略

對于IFNs的用藥，有的專家提出四方面的策略值得考慮：

（1)聚射用藥策略 所謂聚射就是把干擾素直接導人“靶灶”內。如外露的實體瘤可用“浸潤注射法”將干擾素直接注入瘤體內或用導管引入(如腦神經膠質瘤)；若靶灶在內臟，則可采用“磁力導航法”將干擾素導人靶灶內。

（2)聯合用藥策略 在干擾素與抗病毒藥物聯合應用中，現已發(fā)現，有些起“協同作用”，有些起“相加作用”，有些起“拮抗作用”，因此在與有關藥物聯合應用時，事前最好弄清這些情況。

（3)聯合治療策略 就是指以某種獨特的療法配合另一種獨特的療法，以期達到更好的療效。如手術療法對實體瘤體的治療亦是目前公認的一種療法，但當某些實體瘤正在發(fā)展進行時(如瘤體的邊緣界限模糊不清時)，就不宜進行手術，但這時可用高濃度干擾素治療，使其穩(wěn)定下來(如瘤體縮小，邊緣清楚等)，這就可能為手術創(chuàng)造了有益的條件。

（4)調量用藥策略  就是指干擾素的治療用量要“辨病而定”，而不可千篇一律地只求量或只主張用低劑量。近年來亦發(fā)現，低濃度的干擾素可增強NK細胞毒活性，局濃度的干擾素則抑制NK細胞毒活性。

（三)白細胞介素-2

A．白細胞介素-2(IL-2)

a.  IL-2的產生和生物學特性

1．IL-2的產生

IL-2是輔助性T細胞受絲裂原或抗原刺刺激后，而產生的一種淋巴因子。人輔助性T細胞受PHA(植物血凝素)或抗原刺激，鼠輔助性T細胞受ConA(刀豆蛋白A)或抗原刺激均可產生IL-2。人的IL-2產生細胞有末梢血淋巴細胞、脾細胞、扁桃體細胞、骨髓細胞和人白血病來源的傳代的jurkat細胞系，鼠脾細胞、胸腺細胞和傳代的鼠EL4細胞系，以及猿的MLAl44細胞系均可產生IL-2。

2．IL-2的生物學作用

IL-2的生物學作用是以刺激T細胞增生為主，故又稱T細胞生長因子，除此之外還有其他重要功能。

（1)促T細胞增殖 當T細胞受到絲裂原或抗原刺激后，表面出現IL-2受體并與IL-2發(fā)生特異結合，結合后便啟動IL-2受體陽性細胞大量繁殖。受體必須在抗原等刺激后，才能在輔助性T細胞表面表達，相反，靜止的輔助T細胞(也就是未受到抗原刺激的)表面不存在IL-2的受體。

T細胞的激活與增殖分為三個時期：開始是細胞在絲裂原或抗原刺激下產生IL-2和其受體表達；然后進入IL-2依賴期，也就是IL-2與IL-2受體發(fā)生特異性結合和相互作用；三期表現為T細胞被激活，進入穩(wěn)定的、不受外界環(huán)境影響的也不依賴IL-2存在的增殖期。IL-2不僅對輔助性T細胞有增殖作用，對抑制性T細胞也有同樣作用。在體外IL-2作用下增殖的T細胞，仍具有原來體內T細胞的同樣功能，為進一步研究 T細胞克隆、功能結構和治療腫瘤提供了先決條件。

（2)對自然殺傷細胞(NK)的作用 NK細胞在機體內是一種極為主要的殺傷細胞，具有很強的清除腫瘤細胞和被感染細胞的功能。整個NK細胞的活化、分化和增殖均離不開IL-2，只有存在一定生理量的IL-2和干擾素，才能調節(jié)NK細胞保持它的自然殺傷活性。NK細胞是非胸腺依賴性和非MHC限制性的，在一定條件下(如受絲裂原刺激)還能產生IL-2、干擾素、白介素-1、腫瘤壞死因子、集落刺激因子等多種細胞因子。所以，IL-2在NK細胞發(fā)揮免疫調節(jié)、抗腫瘤等功能上具有重要作用。

（3)誘導細胞毒性T淋巴細胞產生和增殖 IL-2是抗原激活的細胞毒性T細胞前體細胞轉化為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的主要因子，只有IL-2存在條件下，CTL的擴增數量和殺傷腫瘤細胞活性才能明顯增強。而CTL在IL-2存在時繁殖非常迅速，特異地殺傷腫瘤細胞，特異地識別腫瘤相應抗原，也是腫瘤浸潤淋巴細胞的主要細胞群，Rosenberg已經證明腫瘤浸潤淋巴細胞殺腫瘤細胞鏈應高于一般LAK細胞殺瘤細胞效應50~100倍。

（4)誘導淋巴因子活化淋巴細胞  在一定量IL-2存在下，淋巴細胞可轉化成不僅能殺傷自身新鮮腫瘤細胞，而且也能殺傷同種異體瘤細胞，還能殺傷對NK細胞敏感和不敏感的瘤細胞，Rosenberg稱此種淋巴細胞為淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)。IL-2可以在體外長期維持LAK細胞的增殖，在體內也具同樣功能。LAK細胞能溶解腫瘤細胞主要依靠溶細胞素(cytolysin)，而且LAK細胞殺傷腫瘤細胞不受MHC限制，具有廣譜殺腫瘤細胞的活性，因此，建立了惡性腫瘤過繼免疫療法(AlT)。

（5)促B細胞增殖分化作用 IL-2能直接和間接(通過BCGF)促B細胞分化增殖，其直接作用說明IL-2具有BCGF的作用，所以，IL-2可以使B細胞分化成熟為能夠產生免疫球蛋白的活化細胞。

（6)IL-2與其他白細胞介素等協同作用 IL-2可以和IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、腫瘤壞死因子、克隆刺激因子等有協同作用，由于IL-2可以使NK細胞增殖、則γ-干擾素產生也隨之增加。IL2在細胞因子作用網絡中起核心調節(jié)作用。相反，TGF-β對IL-2的促細胞增殖起拮抗作用。所以，今后對IL-2與各種細胞素的正負調節(jié)作用研究，將對免疫學基本理論發(fā)展和腫瘤治療學發(fā)展起著重要作用。

b.  白細胞介素-2的臨床應用

IL-2是機體免疫調節(jié)網絡中的核心物質，與其他細胞因子有協同和拮抗作用，共同完成機體免疫機能的平衡調節(jié)作用；能刺激NK細胞、CTL、LAK細胞的活化和增殖，也能促使T淋巴細胞、NK細胞產生干擾素、腫瘤壞死因子等。所以，在抗病毒、抗細菌感染和抗腫瘤等疾病治療中開始大量應用�；�因工程IL-2的問世給臨床治療創(chuàng)立了先決條件。

1．抗病毒感染

在實驗室中已經證明，IL-2對小鼠和豚鼠的HSV感染有明顯的抑制作用。在慢性型活動型乙型肝炎病人的治療中，也已顯示出明顯效果。慢性活動型乙型肝炎病毒感染后，免疫功能失調的病人即轉為遷延型。然而，IL-2確能增強體內的NK、CTL、LAK等殺傷細胞活性，清除被病毒感染的肝細胞。誘生的INF-γ和TNF對病毒再侵入健康肝細胞加以抑制，IL-2對肝細胞起著清理污染的潔化作用。所以國外有人采用IL-2治療慢性活動型乙型肝炎病人，每天靜脈滴注250~1000U，經21d治療后，發(fā)現患者淋巴細胞，特別是CD4⁺細胞明顯增加，NK細胞殺傷活性明顯增強，治療的患者開始有SGPT增高，說明細胞免疫功能增強，破壞受感染肝細胞，這是IL-2效應象征。治療后的患者中，一部分的HBeAg和HBsAg消失，HBeAg抗體和HBsAg抗體出現。

  2．抗細菌感染

    IL-2可治療分枝桿菌引起的慢性感染，如麻瘋病、慢性肺結核等。因為這些病人的表現為細胞免疫功能低下的特征，而IL-2能提高機體清除細胞的能力，所以上述病種也是IL-2治療的適應證。

  3．抗寄生蟲的感染

    IL-2能夠增強瘧原蟲感染的患者T細胞對瘧原蟲抗原刺激的反應，而T細胞可大量增殖，細胞免疫功能也就增強。

  4．艾滋病的治療

  獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)系受HIV感染，而CD4⁺細胞遭大量破壞所致。所以IL-2的產生、IL-2受體表達、INFγ產生都明顯降低。而注射IL-2后，上述數種細胞數及活性均明顯增高。所以用IL-2治療艾滋病能夠顯示出一定效果，能增加患者抗腫瘤和抗其他病毒感染能力，可以改善機能狀態(tài)。

5．IL-2佐劑作用

  國外學者證明，對接種乙型肝炎疫苗無抗體產生反應的小兒，再接種8000U的IL-2，過幾天后再接種乙型肝炎疫苗，則抗HBsAg很快出現陽性，說明IL-2是很強的免疫佐劑。

  6．抗高血壓作用

    有資料報道，高血壓大白鼠，注射IL-2 5000U/kg體重，大白鼠高血壓消失，一年之內不再表現高血壓癥狀，但必須是機能性高血壓，對心血管病理改變者的高血壓無效，這也說明高血壓病是免疫功能失調所致。

  7．抗腫瘤治療

在惡性腫瘤的發(fā)病機制中，非常關鍵的是機體免疫功能失調和免疫監(jiān)視功能低下的問題，這是隨著近年來免疫學的發(fā)展而逐漸被人們所公認的事實。由于免疫監(jiān)視功能低下，表現出細胞免疫功能低下，腫瘤病人體內的NK、CTL、LAK等殺傷細胞功能低下，就不能正常地清除腫瘤細胞。而這些殺傷性細胞的活化和增殖，均是以IL-2為基礎的。

用IL-2培養(yǎng)的TIL做轉基因治療

做轉基因治療時，選用對腫瘤組織親和性較強，而且又在IL-2培養(yǎng)液中能夠很好繁殖的TIL。如何將細胞因子的基因轉入TIL細胞內是一重要問題，Rosenberg采用從鼠類白血病病毒的變異株N2篩選出的逆轉錄病毒載體LNL₆。該株編的碼病毒核心蛋白、病毒逆轉錄酶和病毒包膜蛋白基因都已缺失或截短，所以具有明顯的復制缺陷。同時其序列與人類逆轉錄病毒序列無同源性，排除了與之重組交換而引起病毒復制的可能性，LNL₆的gag(編碼病毒核心蛋白基因)的開放閱讀框架發(fā)生了突變，使之不能產生任何的病毒蛋白質。

Rosenberg用LNL₆載體插入一個細菌的新霉素抗性基因，將攜有重組基因的逆轉錄病毒載體LNL₆與逆轉錄病毒包裝細胞PA317共同培養(yǎng)，分離出一株含有LN乙高滴度的克隆PA317/LNL₆-C₈。然后將此克隆放人Eagle’s培養(yǎng)液中生長，制成含病毒顆粒的上清液。上清液要做無菌試驗、MAP檢測、淋巴脈絡叢腦膜炎病毒檢測等，然后再做小鼠安全試驗。

Rosenberg用5例晚期轉移性黑色素瘤患者的自身瘤組織，在剪碎、酶消化等措施后制得的單細胞懸液，經聚蔗糖泛影葡胺液梯度離心分得TIL。將TIL移人含IL-2(1000U／m1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增，殘存腫瘤細胞全被殺死。當TIL總數達1.2×10⁸~7.6×10⁸時，移出1/3一1/2做轉導實驗，與LNL₆的上清液共同培養(yǎng)，制成轉導的TIL，剩余部分為未轉導的TIL。對轉導的TIL可做安全性檢查，首先要確定是否有輔助病毒、4070A外膜基因和逆轉錄酶，然后用鱟分析檢測該轉錄過程細胞是否產生內毒素，再檢測LNL₆載體所載外源基因，如新霉素抗性基因和表達產物是否存在(如此處插人TNF等基因，也需檢測TNF等基因及表達產物)，然后將該種細胞放在含有IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增和觀察細胞變化，以排除因隨機整合作用而誘發(fā)的癌基因的激活。

每位患者分別接受2次細胞輸液，每次輸入量為2×10¹¹個細胞，每隔8h注人IL-272萬U/kg。Rosenberg要確定外源載體LNL₆在體內的安全性，測定與LNL₆有關項目，確定新霉素抗性基因的存在和體內是否存在有復制能力的逆轉錄病毒，也檢測是否存在與gag抗原(病毒核心蛋白)作用的抗體。

經X線和CT掃描的檢查，治療6天到兩個月后，3名患者腫瘤受到抑制，并出現消退，轉導的TIL在體內至少活存3周，有兩個人的TIL在體內存活可達兩個月，所有病人都未見有因輸入轉導的TIL而引起的副作用，證明此法是安全的。

Rosenberg的工作，取得很滿意的結果。實驗證明具有復制缺陷的逆轉錄病毒作為載體，將一個外源基因(如TNF基因、干擾素基因和IL-2基因等)轉人人體細胞中，治療人類疾病是安全和可靠的。

B．重組人白細胞介素-2

重組人白細胞介素-2(humanrecombinant interleukin-2)是目前批準上市的兩種白細胞介素-2之一。

1．簡稱

rHuIL-2。

2．結構與性質

本品是一種糖蛋白，由133個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，內含一個二硫鍵，由于幾乎含有等量的酸性氨基酸和堿性氨基酸，故其等電點在pI7左右。結構中有3個半胱氨酸(Cys)，Cys58與Cysl05之間形成二硫鍵維持本品的空間構象穩(wěn)定，這是保持活性所必需的，Cysl25的存在易形成二硫鍵錯配，形成二聚體，降低本晶的活性。!由此可見三個Cys在維護生物學活性中起重要的作用。

本品分子量為15000~17000，活性集中在N-端，除去N-端1~10個氨基酸殘基活性降低30％~50％，除去N-端1~20個氨基酸殘基使其活性完全喪失。本品對熱不穩(wěn)定，在65℃中僅保溫30min后其生物學活性基本喪失。若加入1％SDS加熱至70℃保持15min活性不受影響，故SDS可作為本品的穩(wěn)定劑。本品對各種蛋白酶敏感，對核酸酶不敏感。在pH2~9的溶液中穩(wěn)定。并具有明顯的疏水性，這些性質均有利于純化。

3．臨床應用

本品的主要作用是激活免疫效應細胞和產生協同效應因子，共同有效地清除腫瘤細胞和病毒或細菌感染細胞，起到治病防病作用。具體作用是：①激活LAK細胞，清除病毒、細菌感染細胞，因而可以治療病毒性肝炎、分枝桿菌和真菌的胞內感染等；②激活NK細胞，使它們變成LAK細胞，用這種過繼性免疫療法治療腫瘤，對黑色素瘤、腎細胞癌療效明顯，對白血病也有一定療效；③恢復T細胞功能，治療免疫功能低下所引起的疾病或免疫缺陷所引起的疾病。這些作用都充分顯示了臨床應用的良好前景。

臨床使用劑量根據不同病種而異，一般抗感染和免疫調節(jié)適用小劑量，即1萬U~5萬U，每日或隔日一針，肌肉注射。腫瘤治療可用2萬U~10萬U以上，靜脈注射。但用量大毒副反應也大，有時病人難以承受，所以若小劑量能達到治療目的，盡量使用小劑量。應用小劑量在體外誘導LAK細胞，然后再回輸給病人來達到治療腫瘤的目的，效果比較滿意，但此法技術難度較大，有待進一步改進。

4．不良反應

近年來，隨著臨床的廣泛應用，rHuIL-2的毒副反應也逐漸引起人們的注意，成為限制其臨床應用的重要原因，其常見不良反應有：

（1)心血管系統(tǒng)  rHuIL-2對心血管系統(tǒng)的影響較嚴重，常見有血壓降低和心動過速，以及心律失常、心肌缺血、心功能抑制、心肌損傷等。Gaynor等測定了大劑量應用rHuIL-2(3×55U/kg·d)治療36h后和血管加壓支持開始前的幾種血流動力學參數的平均值，結果發(fā)現：平均動脈壓(MAP)從12.2kPa降至9.9kPa；血管阻力(SVR)從2．00kPa/(L·min)降至1.13kPa/(L·min)；心指數(CI)從3.1L/(min·m²)升至4.7L/(min·m²)；肺契壓未變。rHuIL-2治療對左室功能有抑制作用，可使射血分數降低10％~30％。在無冠心病的患者中，可看到肌酸酐酶的升高和心電圖T波的改變。心肌缺血和梗死可能由低血壓所引發(fā)。在rHulL-2治療期間，非感染性心肌炎的發(fā)病率增高，且多以淋巴細胞浸潤為特征。亦見rHulL-2治療期間心鈉素升高的報道。

（2)呼吸系統(tǒng)  Rosenberg等報道在rHuIL-2療程中，有19％的患者發(fā)生肺水腫，其中16例需氣管插管。另一項研究表明，19例患者在大劑量rHuIL-2治療前5天內，分別有21％、23％、54％發(fā)生肺泡水腫、間質性肺水腫和胸腔積液。Villani等對12例黑色素瘤患者rHuIL-2治療前后的肺功能指數做了測定，結果在第直療程(400μg/m²，每日3次，連續(xù)4d)后，其肺總量(TLC)、肺活量(VC)、殘氣量(RV)、1秒量 (FEVl)、最大呼氣中期流速(FEF25~75)、1秒率(FEVl/FVC)、一氧化碳彌散(TLOD)和一氧化碳彌散并泡通氣量(TLCO/VA)均較治療前顯著降低(P<0.05)。第2療程后Pa02顯著降低而PaCO₂則顯著升高，呼吸頻率顯著增加，X線胸片示幾乎所有患者均有不同程度的肺水腫，6例因呼吸困難而需吸氧。

（3)消化系統(tǒng)  Rosenberg等報道在用大劑量rHuIL-2治療期間，大約85％的患者有胃腸不適、食欲不振、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴重者可致結腸局部壞死或穿孔。亦有腹脹、腹水、膽紅素及轉氨酶升高的報道。

（4)血液系統(tǒng)  Michie等報道11例癌癥患者，用藥前肝、腎功能及血細胞計數均正常，靜脈輸注rHuIL-2 30000U/kg后，血白細胞計數先是輕度下降，隨后持續(xù)上升。單核細胞先是迅速下降，隨后逐漸上升，6h后接近用藥前水平。淋巴細胞則表現為持續(xù)下降。中性粒細胞在用藥2h后持續(xù)上升，4h后達穩(wěn)定水平，約為用藥前的2倍。紅細胞及血小板下降在rHuIL-2治療過程中也常見。Klempner等測定了31例癌癥患者rHuIL-2用藥前后的中性粒細胞過氧化物、噬中性顆粒形成分泌、吞噬作用、殺菌力和趨化性，結果在治療前31例患者中性粒細胞測定的各項功能均正常，rHuIL-2治療后，患者中性粒細胞對甲酰肽的趨化性反應受到嚴重損傷，對酵母多糖活性血清的趨化性反應也異常，但中性粒細胞的其他功能則正常。

（5)泌尿系統(tǒng)  常見有體液潴留、氮質血癥、尿量減少等。Belldegrun等報道用rHuIL-或rHuIL-2加LAK細胞治療的癌癥患者，90％有不同程度的腎功能障礙。表現為血肌酐濃度升高、體重增加、少尿、尿鈉排出下降、高尿酸血癥。但治療結束后，這些癥狀可逐步恢復。但患者如原有腎功能異常時，則在rHuIL-2治療過程中腎功能障礙加重，且恢復時間也長。

（6)神經系統(tǒng)  Fenner等報道在625例接受rHuIL-2治療的患者中，33％發(fā)生定向力障礙，5％有明顯的昏迷癥狀。44例大劑量靜注rHuIL-2的患者，22例有嚴重的認知改變、頻繁的焦慮不安、幻覺或明顯的幻覺綜合征。另可見輕度感覺障礙、暫時性肌無力及輕度偏癱。核磁共振表明，rHuIL-2治療后腦中水的成分可增加，可引起血管漏出綜合征。Denicoff等通過分析rHuIL-2對神經內分泌、腦電及行為的影響，認為rHuIL-2可聚集行為激動因子，改變血腦屏障通透性，加強行為激動因子對CNS的作用，直接或間接地影響CNS，從而導致精神癥狀。

（7)內分泌及代謝等系統(tǒng) Michie等報道給予rHuIL-2后，血中兒茶酚胺首先升高，促腎上腺皮質激素、可的松、腎上腺素、去甲腎上腺素、腎素分泌均升高。Atkins等觀察到rHuIL-2與LAK細胞合用時，可使甲狀腺素分泌減退，從而導致內分泌功能的紊亂。RHulL-2治療期間的代謝變化主要是發(fā)熱、寒顫及全身不適等。以及血鈣、血磷、血漿白蛋白降低，大劑量rHulL-2與LAK細胞合用出現嚴重維生素C缺乏。

(8)皮膚反應 Gaspari等報道rHuIL-2治療2~3天后，多數患者出現皮膚紅斑，伴有發(fā)熱和瘙癢。一般局限于頭頸部，有時也可遍及全身。停藥后48~72h可消退，并伴有局部脫皮、皮膚多發(fā)性潰瘍、脫發(fā)、銀屑病復發(fā)等。

對rHulL-2不良反應，多數認為與血管漏出綜合征(VLS)有關。VLS是指毛細血管內皮細胞通透性增加，部分血液成分外漏至組織間隙而引起的一系列病理生理變化，如體液潴留、肺間質水腫、血壓降低、少尿等。Rosenstein等通過大劑量靜注rHuIL-2觀察小鼠VLS，發(fā)現白蛋白持續(xù)向組織滲出與rHuIL-2的給藥劑量及給藥時間直接相關。但預先給予環(huán)磷酰胺或放療后，可部分阻止VLS的出現，而且在無胸腺的裸鼠體內則不引起VLS。表明rHuIL-2并不直接引起VLS，很可能是T淋巴細胞及它們的間接產物所致。

C．新型人白細胞介素-2

新型人白細胞介素-2(¹²⁵Serhuman recombinant interleukin-2)是目前批準上市的另一種基因工程白細胞介素類藥物。

1．簡稱

¹²⁵Ser rHuIL-2。

2．商品名

Proleukin。

3．結構與性質

本品結構與天然的IL-2不同之處是將125位的Cys，通過點突變的方法改為絲氨酸(Ser)。這樣的新型IL-2性質有所改變，即因不易形成二聚體，比活性提高；對熱較穩(wěn)定，在65℃加熱30min，活力仍保持20％左右，失活后恢復活性較快，加熱失活后放置在0.1%SDS溶液中，10min后能恢復原來活性的80％~90％。同時在體內的半衰期也延長了。這些性質的改變均有利于純化和臨床應用。

4．臨床應用

本品是改型的rHuIL-2，優(yōu)點是提高了活性和延長了在體內的半衰期，這樣可減少注射劑量，降低毒副反應。但因與天然IL-2結構不同，改變了一個氨基酸，多次注射后更易產生抗體，一旦產生抗體，不但藥效損失，還有可能引起過敏反應。因此長期使用本品時，應定期測定抗體。

本品的臨床作用與天然IL-2是一樣的，可提高人體對病毒、細菌、真菌、原蟲等感染的免疫應答，使細胞毒性T細胞、自然殺傷細胞和LAK細胞增殖，進而清除體內腫瘤細胞和病毒感染細胞等。還可增進抗體和干擾素的分泌，它是機體免疫應答核心物質之一，是一種免疫增強劑，具有抗病毒、抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用。

本品臨床應用的病種有：①腫瘤：對癌性胸、腹水的控制和消除效果顯著。一般局部注射2萬U~10萬U，持續(xù)至胸、腹水消失�？稍囉糜�腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌伴有的胸、腹水治療；②抗感染：某些病毒性、細菌性和胞內寄生菌感染性疾病，如乙型肝炎、麻風、結核等，肌肉注射本晶2萬U~5萬U，每日或隔日一次，特別對麻風的治療作用顯著；③免疫調節(jié)：手術、化療及放療后，本品可加速機體免疫功能的恢復。本品對于先天和后天免疫缺陷癥的治療也有一定療效。肌內注射2萬U~5萬U，可隔日注射一次。本晶的副作用同天然IL-2。但因用量稍低于天然IL-2，故毒副反應亦較低，產生抗體的比例要比天然IL-2高得多。

5．規(guī)格

同rHuIL-2。

6．貯藏

同rHuIL-2。

（三)集落刺激因子

集落刺激因子(colony—stimulatingfactor，CSF)，是一類能參與造血調節(jié)過程的糖蛋白分子，又稱造血刺激因子或造血調節(jié)因子。早在幾十年前已知促紅細胞生成素與紅細胞生長有關，但直到20世紀60年代后期體外造血細胞培養(yǎng)技術獲得成功后，Bradley等才首次從造血細胞培養(yǎng)中，發(fā)現骨髓細胞要分化增殖為粒—巨噬細胞集落，還需要有一種刺激造血的物質參與，此物質即稱為集落刺激因子。我們知道造血系統(tǒng)的能力在機體內能保持終身供應成熟細胞和對刺激發(fā)生反應，擴大已知細胞類型的數目。機體能夠保持這種能力，提示一定存在一種調節(jié)每個細胞系中細胞的增殖和分化的機制。已知在體內造血是微環(huán)境中短期調節(jié)劑以及血循環(huán)中長期調節(jié)劑同細胞的相互反應的結果。在體外所有非淋巴樣造血細胞可以受一組具有獨特或交叉特異性，來自不同細胞系的集落刺激因子所刺激。

造血因子是由幾種細胞類型合成的，它們之中一些廣泛分布在造血和非造血的組織中。這些生產造血因子的細胞是應用了單克隆細胞系來證實的。用免疫活化的淋巴樣細胞的體外研究首先證實了T淋巴細胞能夠合成其中某些因子，以后從來自不同的T細胞淋巴瘤，雜交瘤和依賴IL-2的細胞系和克隆的證據，表明了其他類型的細胞不存在時它們也產生各種集落刺激因子。用某些單克隆細胞群體作的研究表明單一的細胞克隆，能夠產生幾種不同的，但具有明顯相等形式的細胞因子，包括CSFs、IL-2、B細胞刺激因子和γ干擾素�，F在已知CSF的種類有：粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，多潛能集落刺激因子(Multi-CSF)還有類似CSF活性的促紅細胞生成素(EPO)等。

A．集落刺激因子的分類

根據集落刺激因子刺激骨髓細胞所形成克隆的細胞類型特點，可將它們分為兩大類：一類因子作用于造血干細胞，它們是多能集落刺激因子(multi-CSF，IL3)，粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。一類因子作用于更為成熟的造血祖細胞及其分化的特殊系列的細胞，它們是巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。

近年來的研究表明，集落刺激因子不僅在造血細胞的增殖與分化中起重要作用，而且也參與對成熟細胞的功能調節(jié)，并在宿主抗感染免疫中起著重要作用。

a.粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)

GM-CSF是最早被描述、純化并克隆的造血生長因子之一。其主要來源為T淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、內皮細胞和纖維母細胞。分子量為14000~35000，基因定位在染色體5q。人GM-CSF基因有四個外顯子和三個內含子。GM-CSF有廣泛的特異性作用，除能刺激半固體培養(yǎng)基中骨髓祖細胞增殖、分化形成粒細胞和巨噬細胞集落外，還能刺激嗜酸性粒細胞和巨噬細胞及早幼紅細胞和多潛能祖細胞的初期增殖。此外還發(fā)現GM-CSF除對成熟造血細胞的產生有作用，還能明顯增強成熟細胞對細菌和寄生蟲感染的反應能力。現已證明中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞表面具有GM-CSF特異性受體。所以有學者認為CSF是通過與靶細胞上相關受體的結合而發(fā)揮其生物效應。

GM-CSF是CSF中最重要的一種因子。有二項功能，即：①使造血祖細胞能在體外克隆繁殖并形成集落；②對有兩種發(fā)育傾向的GM祖細胞在其作用下經過1~2次細胞分裂而朝一種分化途徑定向，但對其在體內的功能還缺乏明確的實驗結果�，F在由于有了重組的GM-CSF，對以下兩點有較清楚概念：①GM—CSF具有紅細胞抽芽促進活性。同時， GM—CSF也刺激來自多坦細胞的集落形成。最近在人類膀胱肉瘤細胞株中提純出一種CSF，在理化性質上與GM-CSF十分相似。如果能從一級結構上提供更明確的信息，則GM-CSF在多能干細胞的存活與分化上的作用將更明確。②GM-CSF也能抑制嗜中性粒細菌的轉移，能使細菌性促趨化劑N-甲酰甲硫氨酸—亮氨胱苯丙氨酸(f-MLP)促進超氧離子產生的能力提高4倍。這說明GM-CSF是一種中性粒細胞的活化因子，此外，GM-CSF與一種由T淋巴細胞中提純得到的嗜中性粒細胞轉移因子(NIF-T)具有相同的分子量22000，和相同的N末端。這提示GM-CSF與NIF-T很可能就是同一種因子。

GM-CSF是有種屬特異性的，現在電于重組GM-CSF得到成功，使得GM-CSF已從一種實驗研究的對象成為一種臨床應用的制劑，就有可能用于治療人的造血障礙、免疫缺陷、炎癥反應及腫瘤等方面。

b. 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)

G-CSF主要來源于巨噬細胞、內皮細胞及纖維母細胞。能高度特異性地刺激中性白細胞系的前體細胞存活、增殖和分化，同時也是成熟的中性白細胞的功能活性因子，包括對細菌反應的能力、吞噬功能以及通過ADCC殺傷腫瘤細胞。

G-CSF是糖蛋白，它的分子量是19600。基因定位在染色體17。它的基因含有5個外顯子和4個內含子。已分離出2個cDNA，分別編碼177個氨基酸的蛋白質和174個氨基酸的蛋白質。后者缺失第36、37、38個氨基酸。分析表明兩種形式的G-CSF都有生物活性，但作用上可能有所差別。人和鼠的G-CSF的生物活性和受體結合性有種屬交叉反應。G-CSF在維持體內中性白細胞水平和活性上起重要作用。

高度精制純化的G-CSF同含有N—末端甲硫氨酸而不是O-糖苷化的天然CSF是不一樣的，用鱟試劑來檢測rhG-CSF，以保證從體內試驗中所得到的生物學反應并不是由于內毒素污染制品而引起的，精制的rhG-CSF在0.5mg/ml濃度時，內毒素含量小于500pg/ml。對急性白血病患者化療后用rhG-CSF治療，有效地縮短了中性白細胞的恢復時間。

G-CSF和GM-CSF的異同點：由于G-CSF和GM-CSF在許多相關的臨床病例中可能有用，所以它們之間生物學特性差異，對某些疾病發(fā)病機理的認識有一定的意義。

（1)G-CSF特異性刺激中性白細胞，而GM-CSF則是所有粒細胞的總刺激因子。例如若要通過提高嗜酸性效應細胞水平來治療寄生蟲感染，則GM-CSF作用比G-CSF為好。

（2)GM-CSF是單核細胞和巨噬細胞的強激活劑，而G-CSF則不是。這種激活包括誘導產生諸如腫瘤壞死因子和IL-1一類的其他細胞因子。如需要提高單核細胞和巨噬細胞活性，可選用GM-CSF，而不是G-CSF。

（3)GM-CSF是中性白細胞移動的強抑制劑，然而G-CSF則增強中性白細胞的移動。例如當局部損傷時，GM-CSF可在局部產生，起弱的化學誘導劑作用，抑制炎癥細胞離開炎癥部位，而G-CSF則能增強炎癥細胞向炎癥部位移動。這可能是兩種造血生長因子共同提高宿主防御力的一種途徑。在細菌性膿毒癥時，接觸內毒素可刺激單核細胞、巨噬細胞產生G-CSF，然后G-CSF刺激骨髓產生和釋放中性白細胞，同時受刺激的巨噬細胞產生IL-1，而IL-1刺激T細胞產生GM-CSF和IL-3，以增加骨髓內的骨髓細胞生成和進一步增強白細胞應答。

c. 巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)

巨噬細胞、纖維母細胞、單核細胞等多種細胞均可產生M-CSF，其受體主要表達在中性粒細胞和巨噬細胞上。它能增強巨噬細胞的細胞毒性，是CSF中唯一沒有種間特異性的CSF。M-CSF的分子量為45000~90000，基因定位于染色體5。已知的靶細胞為單核細胞和巨噬細胞。

單拷貝的M-CSF基因長約21×10³，具有10個外顯子，9個內含子。mRNA水平的基因表達是不均一的，mRNA編碼二種不同的M-CSF蛋白，分別為256個氨基酸和544個氨基酸，M-CSF的初級轉錄產物是一種前多肽。加工既發(fā)生在氨基末端，也發(fā)生在羧基末端。但從C末端的缺失突變顯示，僅僅其中150個氨基酸即具有活性。盡管這種蛋白廬是高度糖基化的，但移去與N端相連的糖基化部分，似乎并不影響生物活性。

d. 多潛能集落刺激因子(Multi-CSF)

又稱為白細胞介素-3(IL-3)。Multi-CSF的分子量為14000~28000，基因定位在染色體5。它是由活化的T淋巴細胞產生的。其作用的靶細胞更為原始，能作用于一些具有自我更新能力的多能造血干細胞和祖細胞。在Multi-CSF的激發(fā)下產生中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞、嗜堿性細胞及巨核細胞。其受體同時在嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞及單核細胞上表達，但在成熟中性粒細胞上則不存在。試驗證明IL-3對血細胞數目的影響直接與其對祖細胞功能影響有關。

以上四種集落刺激因子及其作用的靶細胞和分子量列于表3-10。

表3-10  人類集落刺激因子

B．集落刺激因子的臨床應用

集落刺激因子的臨床應用主要包括以下幾個方面

（1)細胞因子的免疫調節(jié)作用。

（2)癌癥病人的治療。

（3)AIDS病患者的治療。

（4)骨髓衰竭狀態(tài)病人的治療。

（5)骨髓移植。

（6)治療骨髓發(fā)育不良。

（7)其他疾�。喝缰委熛忍煨�、特發(fā)性及周期性白細胞減少；治療患白血病、惡性淋巴瘤導致白細胞減少并發(fā)真菌感染的病人等。

a. 重組人粒細胞集落刺激因子

英文名稱為recombinant human granulocyte colonystimulating factor

1．簡稱

rHuG-CSF。

2．商品名

惠爾血、優(yōu)保津、諾以托羅津、Filgratim、GRAM、Neupogen、NEUTROGIN。

3．臨床應用

在細胞培養(yǎng)液中加入G-CSF引起一系列生物功能變化，這些變化不宜完全直接類推于活體，是因機體內復雜環(huán)境所致，如G-CSF與其他細胞因子及內源性G-CFS之間的相互作用等。因此其生物效應體現在：

（1)對造血前體細胞的作用  G-CSF可延長中性粒細胞系各個階段的祖細胞在體內外的存活時間，加速多能干細胞進入細胞周期，刺激其增殖，并且還有誘導分化的作用。不僅誘導正常粒細胞系的分化，還可誘導單核、巨噬細胞的形成及白血病和某些非白血病細胞株的分化。

（2)對成熟中性白細胞的作用  在感染時產生的內源性G-CSF一方面可誘導骨髓產生更多的中性粒細胞，另一方面可促進中性粒細胞向炎癥部位移動，并促其對細菌和真菌，的調理作用及吞噬功能，加強其抗體依賴性細胞毒介導的細胞毒作用（antibody-depen-dent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)以及加快有關的細胞代謝。

（3)對腫瘤細胞的作用  G-CSF能加強中性白細胞對腫瘤細胞的ADCC作用，此作用與G-CSF能誘導出高親和力IgG受體有關。G-CSF還對血液系統(tǒng)腫瘤細胞具有誘導分化作用，如堿性磷酸（NAP)為中性白細胞成熟與否的標志，而NAP活性降低為慢性髓性白血病（CML)的重要特征之一，G-CSF與CML患者血標本共同培養(yǎng)后顯示出 NAP積分增高。G-CSF不僅能誘導CML病人的惡性細胞分化，還能參與誘導白血病 HL-60細胞的分化及急性髓系白血病（AML)母細胞的成熟。

其在臨床治療方面的應用主要包括：

（1)配合抗生素治療嚴重感染性疾病  實驗表明，在注入致死量的金黃色葡萄球菌或綠膿假單胞菌后給予G-CSF，可使小鼠存活期較對照明顯延長；且對單用抗生素無效或效果不佳者加用G-CSF可提高療效。此外，在新生小鼠B型鏈球菌敗血癥，用G-CSF加抗生素治療也取得良好效果�？傊瓽-CSF能為機體提供快速及有效的抗感染體系，特別是危及生命的嚴重感染。

（2)腫瘤化療所致白細胞減少癥  惡性腫瘤、白血病患者在化療后常出現免疫機能受損，特別是引起骨髓抑制，因而反復遭受各種感染。而此時單用抗生素收效不佳，主要原因是他們體內的中性粒細胞（介導機體早期防御機制的重要細胞)功能和數量異常。研究資料表明，結合化療應用G-CSF可刺激大量產生及釋放正常功能的中性粒細胞，加快粒細胞的恢復，使化療所致粒細胞減少及粒細胞減少性發(fā)熱的發(fā)生率降低50％，并且減輕其程度，從而減輕或減少感染，減少抗生素的應用，提高病人對化療的耐受性。

（3)在骨髓移植(BMT)和外周血干細胞移植中的應用 在自體或異體BMT后應用 G-CSF，可以加速中性粒細胞降低癥的恢復，最終降低致死率。用G-CSF活化后的干細胞進行自體周圍血干細胞移植作為BMT的替代或補充，在多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等的治療中取得良好效果，且越來越受到重視。

（4)慢性粒細胞減少癥  用于骨髓增生異常綜合征（MDS)、再生障礙性貧血（AA)、慢性周期性粒細胞減少癥以及艾滋病、放射損傷等所致粒細胞減少，其治療目的在于將粒細胞的數量和功能提高或維持于能預防和對抗感染的水平。體內試驗表明，注射rhG-CSF后外周血白細胞總數、中性粒細胞絕對計數明顯提高，且與rhG-CSF劑量成正比，淋巴細胞（主要是T細胞)數也升高。骨髓細胞增生以粒系為主，可增加5～10倍，并出現髓外造血灶。

（5)白血病的誘導治療  G-CSF對某些人體系白血病細胞株有明顯抑制誘導分化作用，可使白血病干細胞的增加受抑制，并產生不具分裂能力的成熟子細胞。故臨床上已將G-CSF用于治療白血病，應用幾年尚未見嚴重副反應的報道。

4．G-CSF水平測定在臨床上的應用

由于G-CSF是能在于細胞、祖細胞和成熟細胞不同水平上促進中性粒細胞和單核細胞的生成和功能的重要調節(jié)因子，因此G-CSF水平的變化在某種意義上反映了機體造血、血細胞生長、分化、功能及免疫機能狀況。在不同疾病或同一疾病的不同階段，血清或組織液的G-CSF水平不同，故而檢測G-CSF水平具有重要臨床意義。

（1)G-CSF的正常值 G-CSF的基礎水平很低，且各實驗室檢測的靈敏度不同，故目前尚無統(tǒng)一標準。用目前常用的ELISA方法所測得的健康成人最低值是10.9pg／ml，性別間無差異，G-CSF水平與白細胞或中性粒細胞絕對計數（ANC)無關。Shinxxh等測定59例正常足月新生兒出生時的G-CSF，結果10例為20～57pg／ml，其余<201pg／mi，隨后又跟蹤測定了其中16例的變化情況，其中5例無變化，11例在4.5～18hg G-CSF達峰值（26～364pg／m1)。

（2)G-CSF水平與感染性疾病 研究資料證實，細菌及其產物包括內毒素是刺激和 調節(jié)G-CSF產生的重要物質。將細菌或內毒素注入動物體內后血清G-CSF水平迅速上升，可較正常高出1000倍，同時組織合成G-CSF增加。這種現象發(fā)生在數分鐘內，3～6h達高峰，病原微生物及其產物被清除后24～48h內G-CSF降至正常，從而使效應細胞的激活和增殖過程中止。還有實驗表明實驗動物血清G-CSF水平與其感染細菌的數量和細菌在體內繁殖的數量相關。因此，對于細菌性腦膜炎、胸腹腔感染患者，其腦脊液、胸腹水中G-CSF水平較血清G-CSF明顯增高。由此可見G-CSF在機體感染病原微生物過程中不僅是重要的防御機制之一，也是表明病原微生物在體內繁殖與否的一個十分靈敏而準確的指標。由于病毒感染及其他非細菌感染性疾病所致發(fā)熱病人，血清和組織液G-CSF水平無明顯升高，故測定病人G-CSF水平可作為臨床輔助診斷方法，對各類發(fā)熱性疾病的診斷、鑒別診斷有一定意義，也為臨床合理應用抗生素提供幫助。

（3)G-CSF水平與血液系統(tǒng)疾病 ①許多研究顯示，再生障礙性貧血患者血清G- CSF升高，且與ANC呈負相關；也有部分AML、CML、ALL、CLL及MDS病人血清G-CSF升高。上述G-CSF水平上升是否為病原機制的一部分尚無定論；②各類粒細胞減-少癥：研究表明，在自身免疫性細胞減少癥和嚴重先天性粒細胞減少癥（Kostmann綜合征)以及嬰兒慢性粒細胞減少癥患者，血清G-CSF水平升高，特別在ANC<0.5×10⁹/L時更為顯著。此外周期性粒細胞減少癥也發(fā)現G-CSF水平大幅度波動。故測定G-CSF水平有利于疾病的診斷，也可為揭示尚未明確的病理機制提供線索。

（4)G-CSF水平與骨髓移植 Hass等對48例自體BMT或自體血干細胞移植患者血 樣本G-CSF水平進行測定，發(fā)現所有病人在骨髓抑制期均有G-CSF水平顯著升高。平均峰值達2199pg／ml（453～8676pg／m1)。峰值出現時間平均為移植后第5天，與年齡、性別、診斷和移植方式等無顯著相關，而G-CSF水平與白細胞計數呈負相關。Cairo等也報道自體、異體BMT患者G-CSF水平與ANC呈負相關，G-CSF在第5～10天達峰值（699±82.3)pg／ml，同時ANC漸升。而ANC上升至正常范圍是移植成功的關鍵，故提示內源性G-CSF水平可作為BMT預后早期指標之一。

（5)其他：如前所述，rhG-CSF已應用于臨床治療，在治療過程中動態(tài)觀察G-CSF水平可指導藥物劑量和療程的調整，對療效進行評價和觀察。此外部分伴白細胞升高的非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者血清G-CSF水平升高，某些免疫性疾病患者也有G-CSF水-平異常等。因此G-CSF測定對臨床診斷有幫助，對探討疾病的發(fā)病機制也有價值。

（b)重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子

英文名稱為recombinant human granulocyte macrophagecolnystimulating factor。

1．簡稱

rHuGM-CSF。

2．商品名

生白能、Leucomax。

3．藥理學特性

GM-CSF是位于染色體5q21～23基因位點編碼的非糖基化蛋白質，由127個氨基酸組成，其分子量為14370。單核細胞、活化T細胞、成纖維母細胞及內皮細胞均可合成。在體內作用方式為旁分泌，即在造血微環(huán)境中近距離地直接作用于靶細胞，其有效濃度僅10^－12mol／L。GM-CSF受體為一雙鏈分子，其亞基有高親和力和低親和力之分。GM-CSF與其受體的α鏈結合后以激活單核細胞為主，與β鏈結合后則以調節(jié)成熟細胞功能為主。這兩種受體結構在粒系、單核系及成熟細胞上以不同表達形式而啟動這些細胞行使不同效應子的功能。外源性的GM-CSF也可通過這些受體起作用。RhGM-CSF具有天然GM-CSF相同的活性。體外實驗結果表明，rhGM-CSF能刺激骨髓細胞形成CFU-G、CFU-M、CFU-GM，增加中性粒細胞、單核細胞、T淋巴細胞數量，促進巨噬細胞和淋巴細胞對腫瘤細胞的裂解作用，對B淋巴細胞作用不明顯。rhGM-CSF的另一作用就是動員骨髓造血祖細胞進人外周血液。此外，還發(fā)現rhGM-CSF能激活體內成熟單核細胞，增強其殺菌和抗腫瘤能力。給藥途徑多為皮下注射，持續(xù)靜脈滴注亦可。健康受試者皮下注射3—4h達血藥峰值，清除t_l／2為2～3h，靜脈注射t_1/2為1～2h箱常用量為5～10μg／（kg·d)，連續(xù)7～10d。不能與化療藥同時應用，化療停藥后24h方可應用rhGM-CSF，而rhGM-CSF停藥后48h方可開始下一療程化療。

4．臨床應用

rhGM-CSF現已大量應用于骨髓抑制所引起的中性粒細胞減少癥，如常規(guī)化療或大劑量放化療預處理后接受骨髓移植病人的治療，以減輕這些病人中性粒細胞減少的程度和持續(xù)時間，減少感染并發(fā)癥的發(fā)生。

（1)腫瘤放化療后中性粒細胞減少 抗腫瘤藥物的骨髓毒性使化療病人白細胞嚴重減少并導致致命的感染，迫使很多病人在化療的關鍵時刻中斷治療，明顯地影響了腫瘤病人的遠期臨床療效。在化療之間，rhGM-CSF可作為一種支持治療來減輕化療藥物的毒性并加速骨髓增殖，增加外周血白細胞數，提高機體抗感染能力，以利化療方案的實施甚至提高化療藥物的劑量，增加化療的適應證。在小細胞肺癌、乳腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤等實體瘤病人化療后24h開始皮下注射rhGM-CSF 5～10μg／（kg·d)者，中性粒細胞減少時間明顯縮短，發(fā)熱的發(fā)生率減少、持續(xù)時間縮短，感染的發(fā)生率減少、其嚴重程度減輕，抗生素用量減少，住院時間明顯縮短。晚期口腔癌病人化療后給予rhGM-CSF治療者中性粒細胞<0.5×10⁹/L的發(fā)生率21％，而對照病人為90％。小細胞肺癌病人化療后給予rhGM-CSF治療者白細胞最低值為2.3×10⁹/L，對照病人為1.0×10⁹/L，低于4.0×10⁹/L的持續(xù)時間分別為5和10d，白細胞開始恢復的時間分別為12和18d。

（2)急性白血病（AML) AML病人應用rhGM-CSF可縮短化療后中性粒細胞減少的持續(xù)時間并減少感染的發(fā)生率。化療前應用可增加白血病細胞對化療藥物的敏感性。36例（高危HR0AML病人在誘導化療后中性粒細胞減少的持續(xù)時間縮短6～9d（P=0.009—0.043)，化療后早期死亡從39％減少至14％(P=0.007)。體外實驗發(fā)現rhGM-CSF與AML病人骨髓細胞保溫48h后再加人³HAraC保溫24h，³HAraC摻人量增至2.3倍。因此，rhGM-CSF可提高化療藥物的療效。

（3)自身骨髓移植后造血恢復 因考慮到rhGM-CSF有加重移植物抗宿主�。℅VHD)的可能，首先應用于自體骨髓移植（ABMT)病人，涉及的疾病有：HD、NHD、ALL、乳腺癌、黑色素瘤等。有關rhGM-CSF的I～Ⅱ期臨床研究已有多組報道，普遍認為rhGM-CSF不能縮短移植后粒細胞缺乏期，但能顯著加速中性粒細胞的恢復，rhGM-CSF 2～22μg/（kg·d)均有促進造血的作用，并呈劑量依賴性。由于rhGM-CSF毒副作用隨給藥劑量的增加而加重，Visani和Gorin等在進行rhGM-CSF的Ⅲ期臨床研究中，給藥劑量分別定為250μg/(m²·d)或10μg/(kg·d)，移植后當天或第1天開始給藥，當中性粒細胞數連續(xù)3d>1.0×10⁹/L或連續(xù)7d>0.5×10⁹/L時減量至停藥，療程不超過28d。結果表明：①rhGM-CSF明顯促進移植后中性粒細胞的恢復，如Gorin等報道的88例非霍奇金淋巴瘤病人，治療組41例的中性粒細胞>0.5×10⁹/L所需時間的中位值從對照病人的21d提前至14d；②rhGM-CSF對血小板恢復無明顯作用；③感染發(fā)生率明顯減少，美國骨髓移植中心發(fā)現治療組病人感染發(fā)生率較低，發(fā)生咽炎、粘膜炎的病人少，程度輕；④病人住院時間縮短，治療組病人比對照組病人約提前5d出院。Nemunaitis等隨訪27例rhGM-CSF治療病人，1年無病存活率(已活存155～982d)達10％以上，沒有發(fā)現晚期移植失敗的病例。

不是所有的病人對治療均有反應，Blazar等觀察了16例經4-HC、抗T或抗B淋巴細胞McAb體外凈化的ABMT病人，只有5例對rhGM-CSF治療有反應，相關因素分析表明，回輸的骨髓CFU-GM量與機體對rhGM-CSF的反應有顯著的相關性。而Rizzoli等應用rhGM-CSFl0μg/(kg·d)治療13，例ABMT病人，其中9例病人骨髓回輸前給予Asta-z-7557凈化處理，凈化后回輸的骨髓CFU-GM量明顯減少，但移植后粒系恢復同未凈化組相比無明顯差異，中性粒細胞>0.5×10⁹/L所需時間分別為14.2和13.4乙可回輸的CFU-GM不是影響造血恢復的內在因素。進一步研究發(fā)現機體對rhGM-CSF的反應同回輸的CFI-blast量明顯相關，由此提示rhGM-CSF在體內的作用不限于刺激CFU-GM向成熟中性粒細胞分化，有可能刺激較CFU-GM更為幼稚的祖細胞，如 CFU-blast的增殖和分化，而體內一定量早期造血祖細胞的存在是rhGM-CSF發(fā)揮作用的基礎。在有效治療劑量范圍內60—250μg/(m²·d)，rhGM-CSF毒副作用較輕，僅少數病人出現發(fā)熱、骨痛或局部潮紅，個別病人表現有關節(jié)水腫、漿膜腔積液，發(fā)病率隨給藥劑量的增加而升高，對癥治療或停藥后，癥狀逐漸消失。

（4)異基因骨髓移植后造血恢復  同ABMT相比，異基因骨髓移植（allo-BMT)有兩大特點：一是造血恢復慢，感染發(fā)生率高；二是移植后出現GVHR或GVHD。應用rhGM-CSF的目的在于促進移植后造血恢復，是否加重GVHD尚有爭論。一派認為，rhGM-CSF在體內可激活宿主T細胞或增加TNF及IL-1的表達，加重GVHD或增加移植失敗率；另一派則主張，因為移植后感染可加重GVHD，rhGM-CSF加速中性粒細胞恢復，減輕感染，將有利于改善GVHD。臨床觀察表明rhGM-CSF在不加重GVHD的情況下，能加速移植后病人中性粒細胞的恢復；長期隨訪未發(fā)現移植失敗及復發(fā)率的增加。rhGM-CSF促進allo-BMT病人粒系造血恢復的療效似乎不如ABMT病人明顯。幾組有關rhGM-CSF在allo-BMT中應用的報道，盡管病種不同（惡性血液病、再生障礙性貧血)，移植條件有差異（HLA相合與不相合，去T與不去T)，對照設計不統(tǒng)一（以往對照與隨機對照)，但在給藥方案接近的情況下[250μg/(m²·d)或8μg/(kg·d)]，結果卻比較一致：治療組病人移植后9d至14d中性粒細胞明顯高于對照組，淋巴細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞恢復晚于中性粒細胞，均高于對照組；血小板恢復仍較緩慢，未見GVHD加重的報道，移植失敗率無增加，毒副作用與ABMT相比無特殊。通過對allo-BMT病人的隨機雙盲研究發(fā)現治療組病人血紅蛋白、血小板明顯低于對照組，血漿中肌酐、BUN及膽紅素卻比對照組高，分析可能與輕度溶血性尿毒癥有關。

白血病復發(fā)是影響B(tài)MT遠期臨床療效的主要原因之一，盡管rhGM-CSF在體外能擴增髓系白血病細胞，但尚未發(fā)現使移值后白血病復發(fā)率增高的報道，分析可能原因有：①放、化療預處理后殘存的白血病細胞受損或受抑制，在短期內缺乏對rhGM-CSF反應的能力；②體外實驗發(fā)現rhGM-CSF對正常細胞的增殖作用明顯高于白血病細胞。

（5)外周血干細胞動員  rhGM-CSF動員的外周血干細胞（PBSC)移植是其臨床應用中一個有前景的研究方向。生理狀態(tài)下，干細胞在外周血中含量極少，分離困難，不能滿足移植的需要，因此常用環(huán)磷酰胺等藥物動員PBSC，經過一段中性粒細胞缺乏期，干細胞在外周血中反跳性升高，此時可分離出較多的PBSC用于移殖。但因每次分離的PB-SC量不穩(wěn)定，常與骨髓造血細胞聯合移植；化療后應用rhGM-CSF，不僅縮短了中性粒細胞缺乏期，減少了感染并發(fā)癥；而且還使干細胞在外周血中反跳時間提前，幅度升高，通過較少次數的白細胞分離便可獲得大量的PBSC，從而為單獨PBSC移植提供了條件。此外，免疫熒光分析發(fā)現，在動員的PBSC中，CD34⁺HLA-DR-細胞含量增加，富集后體外液體培養(yǎng)，其增殖能力不亞于骨髓來源的細胞，也為PBSC移植提供了理論依據。Serke等對多發(fā)性骨髓瘤病人常規(guī)接受馬法蘭和潑尼松治療后給予rhGM-CSF，病人外周血中CD34⁺細胞升至12.5倍。有報道應用AFM化療方案對16例乳腺癌轉移病人給予4個療程誘導治療，并對l、2療程有反應的病人于第3、4個療程6～15d聯用rhGM-CSF [5μg／(kg·d)]加動員PBSC，動員后每個療程進行2次白細胞分離，移植后不再給予rhGM-CSF治療。結果發(fā)現移植后中性粒細胞≥0.5×10⁹/L時間的中位數為14d，與以往預處理方案相同的29例乳腺癌BMT病人比較，其植入時間、抗生素治療天數、輸血輸液量以及住院時間均明顯減少；僅3例病人因血小板恢復緩慢進行了凍存的骨髓干細胞移植。

（6)移植失敗病人的治療 移植失敗原因復雜，診斷標準不統(tǒng)一。Nemunaitis等認為出現下列情況之一者即可診斷為移植失�。孩僖浦埠蟮�28天中性粒細胞<0.1×10⁹/L；②第21天中性粒細胞<0.1×10⁹/L并伴有致死性感染；③獲得早期植人中性粒細胞≥0.5×10⁹/L維持l周后中性粒細胞又降到0.5×10⁹/L以下并持續(xù)1周以上。對應用rhGM-CSF60～1000μg/(m²·d)治療37例移植失敗病人，其中alloBMTl5例，syn-BMTl例，ABMT21例，療程14d或21d，規(guī)定反應指標是末次rhGM-CSF療程開始后14d內中性粒細胞≥0.5×10⁹/L。結果表明21例對治療有反應，ABMT與allo-BMT間無差異，多數病人中性粒細胞維持在正常水平，100d和1年無病存活率分別為59％和50％，明顯高于以往155例病人的32％和23％，但血小板恢復沒有明顯改善。在ABMT及allo-BMT中，約10％的病人出現不同程度的植入延遲或植人失敗，由于缺乏有效的治療措施，70％以上的病人死于感染并發(fā)癥；盡管報道有少數病人受益于改進的支持治療和二次BMT，但總體活存率并沒有明顯改善，rhGM-CSF的應用無疑給移植失敗病人帶來了一線希望。

（7)急性放射病  1987年Brandao-Mello等首次應用rhGM-CSF治療巴西事故病人，8例病人全身照射劑量為3～6Gy，當外周血白細胞<0.1×10⁹/L時，連續(xù)靜脈滴注rhGM-CSF500μg/(m²·d)直至中性粒細胞>2.0×10⁹/L并維持3d，然后劑量減半繼續(xù)用3d，劑量再次減半又用3d停藥。4例活存病人（其中2例早期開始給予rhGM-CSF，從未發(fā)生感染)中性粒細胞減低天數明顯縮短。1989年圣薩爾瓦多事故3例受照射劑量為3～8Gy的病人接受了rhGM-CSF治療。1990年以色列事故病人于傷后第1～18天接受了rhGM-CSF治療。第4天接受BMT后，為加快骨髓細胞的植入，第5～18天又加用了IL-3，骨髓的植人和造血功能的恢復明顯加快。1991年白俄羅斯1例受12～15Gy⁶⁰Coγ線意外照射的男病人于傷后第3～6天和16～39天接受了rhGM-CSF治療，第6～31天加用了IL-3，傷后第20天白細胞開始上升，第36天達0.5×109/L以上，第40天>10×10⁹/L，第60～110天波動在10～50×10⁹/L之間，但血小板沒有增加，至100天時仍<10×10⁹/L，并一直靠輸血小板懸液維持。傷后第113天病人死于嚴重的雙側肺炎和內出血。上述結果表明，造血細胞生長因子為事故性急性放射病人的治療展示了良好的前景。

（8)對其他白細胞減少病人的治療  臨床實踐中觀察到50％～70％的骨髓增生性綜 合征（MDS)病人應用rhGM-CSF后白細胞計數升高，同時也可使10％～25％病人的幼稚細胞增加，提示rhGM-CSF有致惡變的可能，故有人建議與小劑量阿糖胞苷同時應用。對于再生障礙性貧血（AA)的治療鎊．MDS效果要好，除可升高白細胞數外，還可使紅細胞和血小板數明顯改善，這可能是；hGM-CSF與內源性高濃度促紅細胞生成素（EPO)協同作用的結果。RhGM-CSF可明顯升高獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS)患者外周血白細胞數，改善病人的臨床癥狀，支持抗病毒藥物（AZT、DHPG)的應用，提高病人的生存率。對于特發(fā)性中性粒細胞減少癥病人的治療反應不一，有人建議測定病人CFU-GM來選擇病例。

總之，rhGM-CSF可促進骨髓抑制病人造血功能的恢復，升高外周血白細胞及中性粒細胞，減少感染并發(fā)癥，使原發(fā)病或繼發(fā)感染能得到及時治療，提高病人生存質量，降低病死率。

（C)重組人巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和重組人多潛能細胞集落刺激因子 （humanrecombinantmuitipoteutialcloinyptimulatingfactor，rHumulti-CSF)的臨床應用

1．M-CSF

在臨床方面的應用不如GM-CSF、G-CSF報道的多，究竟其臨床應用前景如何，還有待進一步的研究。1986年有報道人尿純化的M-CSF能使化療所致的粒細胞減少盡快得到恢復。1988年相繼報道了M-CSF在骨髓移植及先天性粒細胞減少癥方面的臨床應用，發(fā)現能促使骨髓移植后造血的重建。先天性粒細胞減少癥患者應用M-CSF后外周血中中性粒細胞輕度增加，單核細胞數并未改變。

2．RHumulti-CSF

可刺激造血干細胞的分化，增強某些免疫細胞的分化，對嗜堿性嗜酸性粒細胞、肥大細胞、單核巨噬細胞均有刺激作用。適用于治療骨髓衰竭、再生障礙性貧血、骨髓異常增殖綜合征等病人的白細胞減少癥，也可用于治療放化療所致的白細胞減少癥和血小板減少性紫癜等，使用劑量視病情輕重而定，一般為250μg/d日皮下注射。

（五)促紅細胞生成素

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)，是由腎臟分泌的一種重要激素。生理情況下它能促進紅細胞系列的增殖、分化、成熟；病理狀態(tài)下，與多種貧血，尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關。其血清濃度隨血氧含量的變化而發(fā)生相應的改變，以維持機體在低氧或高氧環(huán)境中正常的生理功能。EPO通過一反饋環(huán)路調節(jié)紅細胞的產生。（見圖3-2)

圖3-2  促紅細胞生成素的反饋調節(jié)

1906年巴黎大學教授Carnot和De′flandae等發(fā)現低氧能刺激紅細胞加速生成，而且與紅細胞生成組織以外所產生的一種間接液遞性因素有關，他們首次提出紅系造血受激素調控學說。1947年Grant等發(fā)現紅細胞生成的刺激與骨髓本身的血氧飽和度無關。1950年Reismann等證明，骨髓紅細胞的產生受到一種體液性激素即紅細胞生成素調節(jié)。制造紅細胞增多癥的動物模型，發(fā)現血液中雖然紅細胞增多，但FPO的生成低下，骨髓中原紅細胞消失，注射EPO后24h內出現原紅細胞，逐漸向成熟階段演變成幼紅細胞，第四天網織紅細胞增加。

1971年Stephenson等證實在EPO存在條件下，將骨髓細胞培養(yǎng)于甲基纖維素中或血凝塊上，成功地獲得了幼紅細胞和紅細胞的集落。在大量EPO（10～100倍)存在條件下，長時間培養(yǎng)可獲得大型的集落——稱其為幼紅細胞集落群形成細胞(burstforming unit-erythroid，簡稱BFU-E)，在少量EPO存在下，短期培養(yǎng)可獲得小型的集落，稱其為幼紅細胞集落形成細胞（colony-forming unit-erythroid，簡稱CFU-E)。

（A)促紅細胞生成素的生物學特性

紅系祖細胞是只能向紅細胞系方向分化的定向干細胞，分為兩個階段：BFU-E到 CFU-E，CFU-E再進一步分化為原紅細胞直至成熟紅細胞，多能造血干細胞在EPO存在條件下，特異地向紅系祖細胞分化增殖。CFU-E對低濃度EPO發(fā)生強烈的應答反應，加入EPO后7天左右，人CFU-E可增殖形成8～49個細胞的紅母細胞集落，BFU-E的進一步分化需要IL-3或GM-CSF的協同作用，并需較長時間（15d)形成較大的集落（500個紅母細胞以上)。

從人胎肝可獲得純度達18％～55％的BFU-E，來自骨髓細胞其純度為5％～18％。最近應用單抗和免疫磁性小珠從400ml血液可得到純度為57％±14％(45％～79％)的BFU-E。體外培養(yǎng)這些高純度的BFU-E，在開始48h內加IL-3可產生紅系集落，72h后對EPO依賴。僅20％的成人BFU-E表達EPO受體，每個細胞上的受體數遠低于CFU-E。但培養(yǎng)4天后，全部細胞都能與¹²⁵-rhEPO結合，結合量與CFU-E相當。在不含血清的培養(yǎng)條件下GM-CSF和G-CSF能加強IL-3對BFU-E的生長促進效應。給予病人大量EPO，骨髓BFU-E數明顯增高，處于DNA合成期細胞的百分率為9％～38％。體外試驗表明，骨髓BFU-E受EPO刺激后24h內，DNA合成期的細胞增加一倍以上。上述試驗表明BFU-E中至少一部分對Faro反應，甚至在早期EPO亦可促進BFU-E對IL-3反應的敏感性。在不同的BFU-E階段隨著成熟的增加對EPO的反應性增強，骨髓和血液BFU-E的反應亦不一致，因此僅那些愈加成熟且具有分化能力的細胞才對EPO反應，早期細胞結合EPO后數量雖可增多，但不能分化成能合成血紅蛋白的細胞。

從血液部分純化的BFU-E培養(yǎng)于甲基纖維素7d即可分化為CFU-E。從400ml血液可獲得10⁷純度為70％±18％的CFU-E。全部CFU-E均表達EPO受體。但隨著成熟度的增加而降低。由BFU-E向CFU-E分化需要EPO的刺激。CFU-E增殖能力有限，必需EPO才形成克隆向終末分化。正常狀態(tài)下CFU-E處于細胞周期內，大量輸血能減少EPO的分泌和周期內CFU-E，從而阻止CFU-E的分化。缺乏EPO，CFU-E經一個周期后即丟失，而缺少血清時，單用EPO即能刺激CFU-E增殖分化。CFU-E的反應性不相同，有的需在克隆形成前對EPO反應，有的僅需作用1～2h，有的至少要作用24h甚至大于24h。因此EPO作為BFU-E和CFU-E的分裂原刺激其增殖，同時又作為分化原促使CFU-E成熟。

EPO能促進某些非紅系祖細胞，如粒細胞和血小板祖細胞的分化增殖。在含淋巴細胞的培養(yǎng)基中，EPO有巨核細胞(MK)集落刺激因子活性。給終末期腎病患者注射EPO后12周內血小板計數從224×10⁹/L增至253×10⁹/L(P<0.05)，骨髓CFU-MK亦明顯增高。應用放射性自顯影技術發(fā)現巨核細胞上有EPO受體。此外已在體外建立多類對 EPO反應的細胞，可用于研究EPO的生物學效應。

有證據表明成熟紅細胞的主要蛋白——血紅蛋白的合成也受EPO的影響。EPO對珠蛋白基因轉錄的作用，可能先于對血紅素合成的作用。有人指出EPO刺激膽色素脫氨酶的合成，但不降低血紅素合成過程中其他酶的作用。

總之EPO促進紅祖細胞增殖，增加紅系前體細胞的數量，加速網織紅細胞的釋放，而不改變紅細胞周期的時相，具有分裂原和分化原的雙重功能。紅祖細胞對多種調控因子反應，是否對EPO反應取決于其成熟程度，但只有EPO是唯一維持其分化的因子。

（B)促紅細胞生成素的藥理學特性

正常人靜脈注射rHuEPO，血漿峰值出現在注射后0.5h。半衰期在首次注射為5h，多次注射后減至4h箱在慢性腎衰病人，半衰期較正常人為長，但多次注射后亦明顯縮短。多次注射后血漿清除率的增加機理不明，一般認為是rHuEPO反應細胞膜上受體數量或敏感性的上調而不是由于抗rHuEPO抗體的產生。

皮下注射rHuEPO的代謝過程與靜脈注射不同，血漿峰值出現在注射后12～24h，半衰期達20h以上。在注射后48h，血中濃度仍保持較高水平。

血中rHuEPO水平的降低是通過與紅系前體體細胞結合的方式抽提出血清。肝臟在代 謝中的作用不明。從腎臟排出的未經代謝的rHuEPO在5％以下。

rHuEPO的藥理作用并不能在注射后立即表現出來，因為EPO反應細胞的成熟并釋放到外周血需要數天時間。有效者先表現為血中網織紅細胞升高，繼之血紅蛋白(Hb)及血細胞比容(HCT)上升，rHuEPO不僅使紅細胞數量增加，還能穩(wěn)定細胞膜，改善膜的流動性，使紅細胞壽命由21d延長到24d。并能改善骨髓病態(tài)造血，也可以使血小板輕度上升。

（C)促紅細胞生成素的臨床應用

目前重組人促紅細胞生成素(rhEPO)已廣泛應用于治療貧血病人，包括慢性腎功能衰竭引起的貧血、血清EPO水平正常的貧血疾患，例如類風濕性關節(jié)炎、艾滋病、腫瘤所致的慢性貧血和溶血性貧血等，以及外科手術的輔助治療。

（a)慢性腎功能衰竭(CRF)

腎功能衰竭所致貧血是一個復雜問題，貧血原因受多種因素影響，包括紅細胞生命周期縮短，代謝毒素抑制紅細胞生成、鐵及葉酸的缺乏，透析帶來的重金屬毒性、骨髓纖維化、出血和溶血等。但最重要的因素是由于腎臟合成EPO不足，紅細胞生成減少所致。

在EPO試用于臨床以前，多數學者力求應用某種方法促進體內殘存腎組織和腎外組織產  生EPO，以補償其不足，如用雄激素、氯化鈷刺激EPO分泌產生，或通過透析解除循環(huán)中EPO的抑制因子，改善骨髓對EPO的反應性，但療效欠佳。近年來經過大量的動物試驗和臨床觀察，證實EPO用于治療CRF貧血可得良好的效果。

對慢性腎衰依賴透析包括依賴輸血者，rHuEPO可完全糾正貧血狀態(tài)�；颊叩腍CT上升呈現劑量依賴性。Eschbach等對終末期腎衰進行不同劑量rHuEPO治療對比（均以每周3次于透析后靜注)，結果rHuEPO劑量為50μ/kg者每月HCT上升3％，而劑量為150μ/kg者每月HCT上升達8％。龐氏以每次143×147μ/kg皮下注射、每周3次，共治療24例，有效率100％，其中23例停止繼續(xù)輸血。但也有報道少數慢性腎衰患者對rHuEPO的反應不良，推測此類患者除EFE)缺乏外，還有產生早期紅系祖細胞促進因子能力低下等其他原因。部分可能同時缺鐵，補充鐵劑后可以恢復對rHuEPO的反應。研究顯示，rHuEPO還可使患者抗氧自由基損傷的能力明顯增強，在腎衰的治療中，除了改善貧血使輸血減少或停止外，尚可使食欲明顯增加、活動能力及自我感覺改善以及出血癥狀減輕。人類免疫缺陷病毒（HIV)感染相關性貧血80％無癥狀HW感染者，20％艾滋�。ˋIDS)相關性綜合征及71％艾滋病患者有貧血。引起貧血的原因包括病毒直接或間接抑制骨髓干細胞，紅細胞外周破壞增加，各種機會感染和藥物治療，尤其是齊多夫定（zidovudine)對骨髓的抑制作用。1995年已有報告接受齊多夫定治療的艾滋病貧血患者，用EPO治療后HCT顯著升高。輸血需要量減少。Krantz(1995)認為，EPO水平低于500U/L的艾滋病患者，因貧血經EPO治療后，HCT升高0.046，紅細胞輸注量減少，生活質量指數明顯改善。1995年有學者比較了EPO對HIV感染的終末期腎病透析患者和糖尿病、非糖尿病腎病患者貧血的療效。靜脈內給予EPO l00U/kg，每周3次，連續(xù)8周，約80％的患者HCT升高，升高值各組相似。

（C)骨體增生異常綜合征（MDS)相關的貧血

EPO可改善MDS患者的貧血。楊蘇楠等1993年用EPO治療11例MDS患者，其中難治性貧血（RA)9例，RA伴原始細胞增多2例。方法：9例用量為200U/kg，肌注，隔日1次；2例采用劑量遞增法，初始劑量為50U/kg，逐漸加量，6周后達到125U/kg，每周肌注3次，療程l～3個月。結果：顯效3例，有效4例，2例血紅蛋白水平無改善，但輸血次數明顯減少。Hellstroml Lindberg l995年報告，使用EPO治療205例MDS貧血患者，有效率16％。Rase等1995年治療100例，總有效率為38％，其中RA、環(huán)形鐵粒幼紅細胞性難治性貧血和原始細胞過多性難治性貧血Ⅱ型有效率各為39％、17.5％和12.5％。有效者中86％的患者基礎EPO水平低于100U/L，基礎EPO低于100U/L的RA患者有效率54％。治療有效多見于EFE)劑量為150～200U/kg，每周3次時，以上結果表明，RA患者的療效較好，基礎FJK水平低于100U/L的患者最有可能對治療產生反應。

（d)再生障礙性貧血（再障)

1993年李蓉生等報告，6例再障患者用EPO治療，劑量為2萬/次，皮下注射每周3次，療程3個月，不予輸血、雄激素及腎上腺皮質激素。結果血紅蛋白由治療前(61.8±10.3)g/％上升為(91.0±13.1)g/L(P<0.01)，平均上升(29.5±11.3)g/L，其中血紅蛋白上升超過30gA者2例、超過60g/L者1例，2例患者血紅蛋白恢復至120g/L以上。1994年杜楠等治療16例再障患者，初劑量為50～60U/kg，皮下注射，每周3次，1個月無效者劑量逐漸增至200-400U/kg，共3個月，結果總有效率為81％。Imamura等(1995)用EPO重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)聯合治療27例，其中中度再障14例、重度再障13例，EPO劑量為100U/kg，rhG-CSF為400 g / m²。結果顯示 64％中度再障患者和23％重度再障患者治療效果好。提示rhG-CSF能夠協同EPO引起紅細胞增生，尤其對中度再障患者。

（e)腎性貧血

腎性貧血患者的血清ElK)水平明顯減低，因此用EPO治療有效，特別對慢性腎功能衰竭(腎衰)引起的貧血，EPO療效肯定。1993年周明等治療11例年齡20~69歲需用腹膜透析的慢性腎衰患者，治療前均有嚴重貧血，血紅蛋白(57.1±15)g/L，紅細胞(1.89± 0.44)X10¹²/L，HCT為(0.19±0.05)。治療方案：①EFE)每次100~120UA~g，每周3次，皮下注射；②治療前1周開始口服鐵劑；③整個療程中不再輸血。8周后，血紅蛋白升至(108.5±16)g/L，紅細胞升至(3.58±0.59)×10¹²/L，HCT上升至(0.40±0.57)，治療前后有顯著性差異(P<0.01)，患者面色紅潤，精神愉快，食欲增加，體力改善，消除了抑郁感。1995年張榮珍用EPO治療47例，劑量4000U，皮下注射，每周2次，持續(xù)8周。結果45例貧血癥狀明顯改善。1996年樊雨良對35例尿毒癥患者應用EPO治療，始劑量50U/kg，每周2次，待HCT高于0.30，血紅蛋白80g/L以上減量至50u/kg，每周1次，以維持HCT0.30～0.35。6～8周平均HCT上升(0.10±0.03)，生活質量提高，不必輸血，自覺癥狀消失，證明本藥除改善腎性貧血外，還能明顯提高病人的生活質量�？偟膩碚f，EPO治療腎性貧血已取得了世人矚目的成就，兒科所有慢性腎衰患者經數月EPO治療均取得了較好的療效。目前，一般EIK)起始劑量為75～l00U/kg，每周3次，皮下注射，每月進行劑量調整，以便使HCT達到0.33的目標。

（f)早產兒貧血

早產兒貧血在兒科臨床中常見，原因包括血液丟失、紅細胞壽命縮短、低EPO濃度及低反應性、迅速生長引起的EPO稀釋等。1995年Obladen等對800多例早產貧血兒每周使用EP0300～1200U/kg治療。結果輸血患者減少18％。1995年Gleason等報告，157例早產兒每周使用500U/kg EPO加鐵劑治療，結果顯示可刺激紅細胞增生，改善貧血病情，降低紅細胞輸注量。1995年Henry等指出，體重0.8～1.3此嬰兒每周接受EPO治療劑量大于300U/kg及充足鐵劑療效最佳。

   （g)外科術后貧血

1995年Atabek等對40例術后嚴重貧血患者進行了研究，治療1周后，EPO組較對照組HCT顯著升高。2周時兩組HCT均有升高，提示嚴重術后貧血患者有1周的造血遲滯現象，外源性EPO在術后1周內可加快HCT的恢復。Tsuji等(1995)在一項對照研究中給予5例胃癌切除患者EPO200U/(kg·d)，術后7天及術后14天靜脈給藥，結果顯示EPO組HCT術后無顯著改變，而對照組則有明顯下降。術后7天EPO組血紅蛋白濃度明顯高于對照組，表明術后給予EPO可防止術后貧血，降低術中及術后的異體輸血需要量。

（h)癌癥相關性貧血

癌癥患者普遍存在貧血現象，其原因是EPO的產生減少和反應性降低所致。Henry等(1995)報道，413例實體瘤及血液系惡性腫瘤貧血患者，皮下注射EPO 100～150U/kg，每周3次，維持8～12周，治療1個月后，化療患者的輸血需要量減少。治療 3個月后患者紅細胞壓積(HCT)顯著升高，58％化療者HCT至少升高0.06。治療6個月后非化療患者輸血需要量亦明顯減少。Garton等(1995)用EPO治療多發(fā)性骨髓病 (MM)貧血患者25例，劑量為150U/kg，每周3次，無效時加倍。EPO治療組60％患者HCT達到或超過0.38，無需輸血，對照組則無反應。Sicvestris等(1995)報告EPO治療54例MM患者的療效，劑量為重50U/kg，每周3次，從第6周起增至300U/kg，直至24周為止。EPO治療組78％患者血紅蛋白水平升高，5例輸血依賴者在3個月后也未輸血，其中4例化療抗拒者加用干擾素治療后血清IgM升高，提示干擾素加EPO治療MM患者對恢復正常B細胞功能是有益的。

（i)其他貧血

有報告用EPO治療4例系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并貧血的女性患者，劑量2000U，皮下注射，每周3次，療程3個月。結果血紅蛋白由(83.5±6.9)g/L，上升為(121.3±16.1) g/L，平均上升(41.3±17.1)g/L。系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并貧血主要是由于患者血清中有抑制造血因子存在，應用大劑量EPO可以拮抗該因子對紅系祖細胞的抑制而糾正貧血。另外有報告(1992)EPO對類風濕性關節(jié)炎合并貧血、慢性感染性貧血、孕產婦貧血均有效，但其確切療效及安全性尚待進一步觀察。

（D)  影響重組促紅細胞生成素療效因素及其副作用

（a)影響重組促紅細胞生成素(rhEPO)療效因素

rhEPO已廣泛用于臨床治療，但發(fā)現越來越多的患者對rhEPO的治療有抵抗現象，下面就分析產生rhEPO抵抗的原因及可能的處理對策。

1．鐵缺乏與鐵負荷過重

鐵缺乏是引起rhEPO抵抗的最主要原因。促紅細胞生成素刺激紅系祖細胞，同時也需要足夠的鐵以合成血紅蛋白。臨床發(fā)現，rhEPO的使用將增加鐵的利用而耗盡貯存鐵，伴隨著rhEPO的治療，鐵缺乏亦越來越嚴重，最后患者出現持續(xù)性紅細胞計數下降，這時需要增加rhEPO的劑量，才能維持HCT及Hb在一個滿意的水平。因此，在rhEPO治療期間，大多數患者需要同時補充鐵劑。Drueke等認為，由于口服鐵不能很好地被吸收，為滿足接受rhEPO治療者鐵的需要，靜脈補鐵比口服補鐵更有效。

補充鐵劑是糾正rhEPO抵抗的有效方法，但發(fā)現部分患者補足貯存鐵后，仍呈現 rhEPO抵抗現象。Goch等研究5個維持性血液濾過的患者，所有患者都同時接受rhEPO及鐵劑治療，但當血清鐵蛋白明顯增高達2667±8p8幾后，rhEPO的劑量逐漸從100U/kg增加到400U/kg，每周3次皮下注射，Hb并沒有明顯升高，當給予鐵螯合劑去鐵胺 (desferrioxamine)治療，同時停止補鐵，I-lb才逐漸升高，rhEPO劑量從400U/kg減到25U/kg，每周3次皮下注射，此時血清鐵蛋白水平隨之下降，I-lb仍保持在理想水平，說明鐵負荷過重也可引起rhEPO抵抗。這是因為體內積聚的鐵不完全具有生物利用度，去鐵胺可以提高貯存鐵的生物利用度，因此可用于治療鐵負荷過重并對rhEPO抵抗的貧血。

2．維生素缺乏及營養(yǎng)不良

Gastaldello等觀察維生素C治療rhEPO抵抗病人，一組鐵負荷過重對rhEPO治療產生抵抗的患者，用維生素C治療2～4周后，HCT及Hb逐漸上升到理想水平，其中l(wèi)例在停用維生素C后，HCF下降，重新給予維生素C后HCT又上升。2例持續(xù)補充維生素C，則減少rhEPO劑量亦能維持HCT及Hb在理想水平。補充維生素C可使組織鐵動員出來，從而防止rhEPO抵抗。Cristol等給一組接受rhEPO治療的血液透析患者口服維生素E后發(fā)現，在維持穩(wěn)定的Hb濃度時，其rhEPO的劑量逐漸減少。進一步實驗證實，脂質過氧化是EPO抵抗的因素之一，所以用維生素C、維生素E等外源性抗氧化劑可節(jié)約rhEPO劑量。此外，維生素B₁₂、葉酸及維生素B₆缺乏也可通過減少rhEPO對紅細胞生成的刺激而發(fā)生rhEPO抵抗效應。

營養(yǎng)不良是透析患者的一個普遍問題，Kamyar等根據SCA(suhjective globalassessment)積分將透析患者分為營養(yǎng)不良、輕度營養(yǎng)不良和營養(yǎng)良好3組。結果發(fā)現，營養(yǎng)不良的患者EPO的需要量大于營養(yǎng)良好者。因此，SGA可以作為尿毒癥患者rhEPO抵抗的一個指示法。

3．鋁中毒

鋁中毒與EPO抵抗有關。體內過量的鋁可能來源于攝人的磷酸鋁凝膠或鋁污染的透析液。Rosenlof等報道，當患者血清鋁水平大于225g/L時，呈現rhEPO抵抗反應，這些患者體內同時呈現較高的紅細胞原卟啉水平。作者認為鋁介導rhEPO抵抗可能繼發(fā)于紅細胞生物合成過程中干擾了鐵的轉運。Bia等也證實有鋁中毒的終末期尿毒癥者，不管用多大劑量的rhEPO，都不能糾正貧血，除非鋁中毒被糾正。認為這是由于鋁抑制Hb的生物合成，降低了鐵的利用和(或)干擾影響了鐵轉運的緣故。Casati等對9例血透患者進行研究，5例用去鐵胺治療，經過6個月的觀察，這5例患者血清鋁水平降低，同時對需要用rhEPO來維持HCT的靶目標的劑量減少，認為鋁可降低最初的rhEPO反應。去鐵胺治療可以降低最初的rhEPO反應。

4．甲狀旁腺功能亢進

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進是慢性腎功能衰竭患者常見的臨床表現。在rhEPO問世之前，已有報道甲狀旁腺激素(PTH)可使內源性EPO對紅細胞生成的作用降低。近年Rao等報道，甲狀旁腺激素對rhEPO也有類似的作用，作者將18例接受rhEPO治療的血液透析患者分為兩組，一組對rhEPO治療反應差，另一組對rhEPO治療反應良好。為維持HCT在35％的水平，前者所需要的rhEPO劑量是后者的3倍多。前者平均血清PTH濃度及骨髓纖維化的程度較后者高，亦即繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進及骨髓纖維化程度越嚴重，對rhEPO的需要量就越大。這是因為PTH直接抑制紅細胞生成并可導致骨髓纖維化。甲狀旁腺切除術后，可糾正這一抵抗現象。

5．感染與炎癥

紅細胞的生成被不同的調節(jié)因子所控制。EPO只是紅細胞生成的最后一個階段起主要調節(jié)作用的因子。EPO的靶細胞是紅系祖細胞，它誘導紅系祖細胞的增殖和分化，促使紅細胞生成。紅細胞生成過程中還受幾種細胞因子的反向調節(jié)，這些細胞因子是白介素 (IL-1、IL-6)、腫瘤壞死因子-(TNF-a)和干擾素—了(IFN-g)等。上述細胞因子在炎癥反應時均是升高的，它們不僅抑制內源性EPO的產生，也抑制紅系干細胞的增殖作用。Marian等發(fā)現，外周血單核細胞產生的IL-6及IFN-g的量與rhEPO的劑量有直接的正相關關系。眾所周知，血清C-反應性蛋白(sCRP)是感染和炎癥活動的預測指標。Peter等研究了sCRP與rhEPO劑量的關系，發(fā)現sCRP水平越高，血液透析患者所需rhEPO劑量也越大，兩者存在正相關系，認為sCRP可作為預測rhEPO抵抗的指標之一。有報告用環(huán)孢素(cyclosporin)糾正1例慢性腎衰竭患者的貧血。該患者用rhEPO1800U/周，但Hb仍很低(60g/L)，予以環(huán)孢素治療后，所需要的rhEPO劑量減少到 4000U/周，Hb上升到100g/L�；颊哂铆h(huán)孢素治療前，sCRP降低了50％左右。Muirhead等的報道也提示急性感染和(或)炎癥的終末期尿毒癥患者顯示有rhEPO抵抗。從體外實驗中觀察到給大鼠注射細菌脂多糖(LPS)或IL-l后，腎臟EPO基因表達受抑制，同時EPO合成也受抑制。Hoen等對慢性血液透析患者的一個中心前瞻性研究發(fā)現與EPO抵抗有關的貧血可能是菌血癥的一個危險因素。另外，血液透析患者中有系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動者、有尿毒癥心包炎者均可發(fā)生EPO抵抗。

6．rhEPO抗體

Peces等報道1例38歲男性血液透析患者，開始用rhEPO劑量為20U/kg每周3次，有良好反應，隨著rhEPO用藥時間延長，卻缺乏治療反應，在治療12個月后，盡管rhE- PO劑量增加到35U/kg，每周3次，Hb及HCT仍不提高，作者未發(fā)現有其他引起rhEPO抵抗的原因存在。用酶聯免疫測定發(fā)現該患者血清中存在抗rhEPOIgG抗體，此后用潑尼松30mg/d治療后，抗rhEPO抗體滴度降低，且患者貧血改善。這一發(fā)現說明rhEPO盡管僅有弱的免疫原性，但仍可誘導機體產生IgG抗體，該抗體可能引起rhEPO抵抗。

7．其他

lfudu等報道，終未期尿毒癥患者對EPO治療反應低下與透析不充分有關，對這些患者增加透析強度，HCT明顯升高。有報道持續(xù)性血液透析患者用不同的透析器，則對 rhEPO的需要量也不同。作者比較了采用聚砜膜透析器的患者與采用銅仿膜透析器的患者，發(fā)現前者對rhEPO的需要量明顯高于后者。故血透患者對rhEPO的抵抗除與透析強度有關外，還與透析器的生物相容性有關。Navarro和Sami等分別對腹膜透析及血液透析患者作前瞻性研究，發(fā)現應用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEl)的患者rhEPO需要量增加，這是因為ACEI本身可以引起貧血，并且還可通過血中血管緊張素生成減少而在骨髓水平抑制造血。引起rhEPO抵抗的其他因素還包括溶血、血紅蛋白病、骨髓纖維化、惡性腫瘤及其治療時用的化療藥物等。

因此，慢性腎衰竭貧血患者在接受推薦劑量的rhEPO治療過程中出現HCT和Hb不隨治療而增加時，則應考慮有rhEPO抵抗，并逐一尋找其原因，采取相應措施糾正這些現象。

1．高血壓

經過大量的動物試驗和臨床觀察表明，rhEPO用于動物劑量高達20000U/kg和人體內3000U/(kg·d)時，并無明顯的急性毒性，rhEPO用于治療CRF期間，可出現一些副作用，其中最常見且重要的是患者血壓升高，出現高血壓或原有高血壓惡化，特別是紅細胞壓積快速上升者最明顯。通過降低rhEPO的劑量(如50U/kg，每周三次)，使血細胞壓積每月增加3％～4％以內，總壓積不超過36％，可降低高血壓的發(fā)病率，僅少數患者需用降壓藥物治療。高血壓的原因可能與紅細胞壓積升高及周圍血管阻力增加，血漿體積下降、血液粘滯性增高有關。由于用rhEPO治療非腎性貧血并不引起高血壓，因此EPO本身不是高血壓的原因。

  2．血栓形成

  有些患者在經過rhEPO治療后有發(fā)生高凝的傾向，但發(fā)生嚴重的血栓形成仍少見。因此有作者指出，如發(fā)現患者有凝血的趨勢時需用小劑量的肝素治療。

3．血清鐵、葉酸、維生素B₁₂缺乏

rhEPO治療期間可以引起血清鐵、葉酸、維生素B₁₂的缺乏，其程度與Hb的上升呈負相關。治療過程中應注意監(jiān)測，及時補充。

4．抗藥性

某些感染情況和炎性疾病可導致rHuEPO獲得性抗藥性，可能是腫瘤壞死因子、IL-l或干擾素釋放而減少了骨髓對rHuEPO的反應。體外觀察紅斑狼瘡和類風濕性關節(jié)炎患者自身血清可以明顯抑制rRuEPO對CFU-E的作用，說明患者血清中存在干細胞抑制因子，已經證明此抑制因子為IL-1。加大rhEPO劑量可以解除此種抑制作用。

5．其他

部分患者有血小板增多癥、高血鉀癥、血漿尿素濃度升高、流感樣癥狀如肌痛等。這些癥狀可通過rhEPO逐漸減量而消失。

（E)促紅細胞生成素的發(fā)展前景

隨著EPO及其受體基礎研究的深入，作用機理逐漸明顯，將有利于闡明紅系造血的發(fā)生與發(fā)展�？蓸O大地推動臨床廣泛應用。目前人們不僅可以從尿液中提純EPO，還可以通過基因重組的方法制備EPO，因此一次性獲得的產量較大，可以滿足臨床治療的需要。

（a)慢性腎衰與EPO的應用觀察

在美國慢性腎衰病人逐年遞增。1972年有10000例慢性腎衰病人，其中3000例做了腎移植手術，1988年慢性腎衰病人已上升至147000例，行腎移植的約為3700例，到 2000年，慢性腎衰病人將達到240000例，慢性腎衰的許多癥狀均與貧血有關，以往常用治療方法是雄激素療法，但此療法僅對一部分病人有效，并有很大的副作用。輸血療法只能暫時改善血細胞比容，但卻有HIV、乙肝病毒、丙肝病毒感染的危險。且輸血超過200次以上時，過量的鐵負荷亦將成為一個嚴重而棘手的問題。EPO在美國使用以后，已使 150000病人順利地進行透析或腎移植治療，對慢性腎衰的治療有著重要的意義。

（b)用EPO治療多發(fā)性骨髓瘤相關性貧血

貧血是多發(fā)性骨髓瘤(MM)常見的并發(fā)癥，常提示預后差，其機理尚不清楚，可能是EPO受抑制起決定作用。用EPO治療MM相關性貧血，結果認為它是一種有希望的藥物。

（c)與其他細胞因子聯合應用以提高療效

如與CSF聯合治療等，但也應盡量不斷提高制品質量，以降低副作用。目前已有多家公司制備的EPO進入臨床應用。如自體輸血、取代輸血，或用于早產兒未成熟期合并貧血、類風濕性關節(jié)炎化療，手術前后使用，有些病種如腎病繼發(fā)貧血、艾滋病或由治療所致的嚴重貧血、腎病末期并發(fā)貧血等。令人矚目的臨床療效，已使EPO成為眾多細胞因子中最具有前景的生物制劑之一。

（六)人生長激素簡介人生長激素

（A)人生長激素對人體所有組織（神經組織除外)都有促生長功能(包括骨骼、肌肉、結締組織、毛發(fā)和皮膚)。還能促使脂肪、糖類的降解，增進蛋白質和核酸的合成。這種生理功能不是生長激素直接作用于細胞的結果，而是通過細胞釋放生長因子(1GF)的作用。人的生長激素種屬特異性很強，動物的生長激素人不能使用。過去在臨床上應用的生長激素只能從人的腦垂體提取(3mg～5mg/個)，來源十分困難，限制了臨床上的研究。自從基因工程技術誕生之后，1985年美國FDA首先批準了重組人生長激素上市。然后瑞典、法國、丹麥也相繼批準。我國也已批準上市。

目前，生長激素主要用于治療侏儒癥、燒傷、創(chuàng)傷、骨折、出血性潰瘍、肌肉萎縮癥、骨質疏松等癥。對毛發(fā)生長和乳汁分泌也有良好的效果。此外，對免疫系統(tǒng)的增強也有一定作用。

重組人生長激素

英文名稱為recombinanthuman growth hormone。

1．  簡稱

Rhgh

2．  商品名

Somatren、Somatren、Somatonorm、Norditropin、Protropin、Humatrope。

3．結構與性質

本品是人腦垂體前葉分泌的一種非糖基化蛋白質激素，含有191個氨基酸殘基，其中有四個半胱氨酸，形成兩對二硫鍵。N端和C端皆為苯丙氨酸，分子量21500，等電點pI為5.2。大腸桿菌表達的本品N端多了一個甲硫氨酸成192個氨基酸，但不影響其生物學活性。然而給人臨床使用后，其抗體產生率達30％以上，使用N端不含甲硫氨酸的本品后，抗體產生率僅為5％，臨床實驗證明，抗體的產生不抑制本品的促生長作用。

4．臨床應用

本晶能促進骨骼、內臟和全身生長，促進蛋白質合成，影響脂肪和礦物質代謝。在人體生長發(fā)育中起著關鍵性作用。這些生理功能不是本品直接作用于細胞的結果，而是通過細胞釋放促生長介素(somatomedin)等生長因子的作用，例如類胰島素生長因子I等。

本品主要用于治療兒童自發(fā)性垂體性侏儒癥，使用劑量每周為0.5U/kg或0.125rog/kg，皮下或肌內注射，可連續(xù)使用3個月至2年，平均增高(10.5±2.2)cm/年，療效顯著且安全。此外，臨床上尚可用于治療燒傷、骨折、創(chuàng)傷、出血性潰瘍、特納綜合征、組織壞死、肌肉萎縮癥、骨質疏松和肥胖癥等。亦可用于運動員健身等。使用劑量視不同情況而異，或遵醫(yī)囑。

長期使用本品是安全的，偶有不良反應，如鼻炎、發(fā)低燒、頭痛、注射部位疼痛、喉炎、咳嗽等，一般均能自愈。而且這些反應一般出現在治療早期，繼續(xù)使用，不良反應會消失，所以不能肯定這些反應是由藥物引起的。

rHGH只適用于內源性生長激素缺乏的兒童長期應用，一般不用于15～16歲以上的男性或14～15歲以上的女性病人，腫瘤患者、糖尿病患者，顱內進行性損傷者均禁用，有這類病家族史者也是慎用。

5．規(guī)格

41U，121U兩種規(guī)格。

（七)表皮生長因子

早在20世紀60年代初，Cohen博士在純化小鼠頜下腺神經生長因子（NGF)時發(fā)現一組可促進新生小鼠開瞼、長牙且對熱穩(wěn)定的蛋白質，隨后將這一活性組分加入培養(yǎng)的皮膚表皮時發(fā)現，它可直接促進表皮的生長，為此而定為表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF)，從此開辟了有關表皮生長因子研究的新領域。眾多的研究表明，EGF可用于角膜、燒傷及手術等創(chuàng)傷的修復和愈合。但天然的EGF在人或動物體內含量甚微，難以大量制備供應臨床。20世紀80年代以來，創(chuàng)傷領域以EGF的發(fā)現及廣泛的生物學活性研究成果為契機，通過基因重組技術，已成功地生產出高純度且活性和結構與天然產物高度一致的重組人表皮生長因子（rhEGF)，為EGF在體表創(chuàng)傷和角膜創(chuàng)傷方面的大規(guī)模應用提供了現實的可能性。

（A)rhEGF的生物生理基礎

自EGF發(fā)現以來，眾多的研究均表明了細胞膜上EGF受體與EGF結合后形成受體-EGF復合物，通過自磷酸化等一系列生化反應誘導或直接調控細胞增殖的一系列重要基因，啟動創(chuàng)面修復的過程，對上皮細胞具有強烈的促生長作用，EGF在體液中含量普遍較低，除在尿中濃度呈年齡依賴性外，在各種生理和病理狀態(tài)下均無明顯變化，因此認為EGF不屬循環(huán)激素。多類表皮細胞群的生長對EGF的局部刺激能作出靈敏的應答反應，且為這些表皮的高速更新必需。rhEGF是通過基因片段在大腸桿菌表達系統(tǒng)充分表達而獲得的與天然EGF活性和結構高度一致的產物，因此理論上rhEGF在活體內亦參與同樣的生理過程，具有相同的生物學活性。

（B)rhEGF作用機理

體表創(chuàng)傷包括機械創(chuàng)傷、燒傷和潰瘍等。創(chuàng)面的愈合過程是一個十分復雜的生理學過程。傳統(tǒng)藥物促創(chuàng)傷愈合能力有限，創(chuàng)傷自我修復能力依賴于內源性EGF的釋放與參與。 EGF可增強細胞移動、分裂生長和細胞間質蛋白合成能力，促進新血管形成及核酸、蛋白的合成，從而通過組織增生和重要胞間基質的合成來促進各類創(chuàng)面的愈合。在創(chuàng)傷修復過程中，隨著成纖維細胞和其他細胞遷移至損傷部位，EGF對炎性細胞、成纖維細胞、表皮細胞、血管內皮細胞有趨化作用，使其向創(chuàng)傷部位移動、分裂增生。創(chuàng)傷部位ECF受體數目增加，內源性EGF也在修復位點積聚，但由于機體體液中EGF含量普遍較低，即使所有積聚在創(chuàng)面的內源性EGF均可與受體結合，其管制環(huán)境中EGF也沒有達到最適水平，亦滿足不了細胞增殖和肉芽組織發(fā)育的最大需要，因而創(chuàng)面對外源rhEGF的處理就可作出細胞增殖和肉芽組織發(fā)育加速的應答反應，最終表現為創(chuàng)面愈合速度的加快。 rhEGF體外促表皮細胞及皮片生長作用

（C)EGF具有加速表皮生長的作用。

為考察rhEGF有無類似效果，近年來國內亦做了大量的研究工作。有人采用表皮細胞培養(yǎng)法觀察了rhEGF對大鼠表皮細胞生長的促進作用。將大鼠表皮細胞分離制成細胞懸液，分別加入含有不同濃度rhEGF的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，結果表明了rhEGF可有效增強表皮細胞活力，接種后很快貼壁，生長出圓形透明細胞，聚集而形成眾多細胞群落并以單層形式向外生長蔓延，彼此融合成片。并且在一定的濃度范圍內，細胞生長面積與濃度存在著依賴性，其中10ng/ml作用最為明顯，約是對照組的2.1倍。按上述方法進行體外人皮片培養(yǎng)，同樣證明了rhEGF具有加速皮片生長作用，與上述結果具有一致性。在近期的實驗中發(fā)現，rhEGF促皮片生長作用除在一定的濃度范圍內皮片生長面積與劑量呈正相關外，與rhEGF的連續(xù)性接觸也有密切關系。皮片培養(yǎng)動態(tài)觀察結果提示了培養(yǎng)前4天生長速度最快，隨著rhEGF與皮片受體的結合，其在培養(yǎng)液中濃度逐漸降低，隨后皮片的生長速度也逐漸變得平緩。rhEGF濃度在1～50ng/ml范圍內均表現出了明顯的促皮片生長作用，當>50ng/ml時作用抑制，可能質膜上的EGF受體數目受到rhEGF的“負調節(jié)”作用（down—Regulation)所致。

（D)藥效學實驗研究

EGF用于創(chuàng)傷修復的效果已被一系列運動實驗所證實。EGF用于創(chuàng)傷實驗如皮膚切割傷、燒傷和角膜損傷等動物模型都能有效地增加創(chuàng)面愈合速度。最早的一個實驗是在局部使用EGF，加速了兔耳全皮層皮膚創(chuàng)傷的愈合，隨后在不同的實驗中，使用豬皮膚的創(chuàng)傷和燒傷模型也表明了EGF加速表皮再生的速度。另有人采用一種海綿作為藥物“緩釋”載體植于小鼠皮下，然后向海綿內注入不同濃度的rhEGF，結果發(fā)現有加快上皮重建及提高創(chuàng)面的抗張強度作用，并與促進創(chuàng)面愈合及肉芽組織形成存在著劑量依賴關系。而且一系列動物模型研究還證明，rhEGF可促進潰瘍化燙傷創(chuàng)面的上皮重建和肉芽組織的形成。近年來，關于 rhEGF與角膜創(chuàng)傷方面的體外研究報道較多，結果均一致表明，滴用rhEGF可促進動物和人角膜上皮的增殖。不同方法造成的創(chuàng)傷包括劃痕、有機溶劑或輕度化學物質燒傷，EGF增加表皮愈合速度較對照提高30％。另一些研究也證明了rhEGF不僅可以刺激上皮細胞的增殖，而且亦可刺激角膜基質角化細胞和內皮細胞的增殖。rhEGF與新地卡特隆協同局部給藥可使靈長類動物損傷角膜上皮修復速度加快，誘導創(chuàng)傷周邊區(qū)細胞的迅速增殖，且再生組織完全正常。rhEGF對角膜堿燒傷及角膜手術造成的角膜創(chuàng)傷有較好的促愈合作用，可使燒傷創(chuàng)面面積迅速縮小。與類固醇類藥物協同給藥則可有效地阻止角膜復發(fā)性糜爛和穿孔，并能促進上皮和內皮細胞增殖及膠原蛋白含量增加，加快創(chuàng)面愈合。

（E)rHEGF臨床應用

大量的臨床應用研究表明，rhEGF用于處緲卜科傷口時，可使傷口纖維細胞大量增殖和膠原纖維明顯積累，創(chuàng)面抗張強度顯著增強。早在20世紀80年代末，Brown等采用隨機雙盲法，用含有r醫(yī)學招聘網hEGF的磺胺嘧啶銀軟膏處理燒傷病人的皮膚移植及供皮區(qū)創(chuàng)面，結果發(fā)現試驗組創(chuàng)面愈合速度較不含rhEGF對照組愈合時間顯著縮短。在角膜上皮移植病人隨機雙盲臨床試驗中，rhEGF使角膜上皮重建速度較安慰劑組快3～4倍。Daniele等給3個因患神經營養(yǎng)性角膜炎而使角膜上皮永久缺損的病人應用rhEGF處理后，病人完全康復。一項多中心臨床試驗觀察了104例不同角膜病病人，結果更全面反映了rhEGF的臨床療效，并解決了傳統(tǒng)方法難以解決的角膜上皮重建和角膜穿孔性糜爛等問題。近期由國家衛(wèi)生部藥品審評中心批準的廣州華生基因工程有限公司生產的rhEGF多中心臨床Ⅱ期研究，采用自身對照法，共觀察各類燒傷創(chuàng)面及難愈性潰瘍創(chuàng)面的患者345例，結果顯示（未發(fā)表資料)，rhEGF對各類燒傷創(chuàng)面的愈合速度明顯加快，顯效率均在80％以上，總有效率達93.48％，其中對加速肉芽創(chuàng)面的愈合作用最為明顯，較對照組提前愈合 15d左右。對其他各類創(chuàng)面的愈合速度亦有顯著加快，較對照組提前愈合3～7d不等；在16例各種難愈性慢性潰瘍創(chuàng)面顯示出獨特療效，上述各類潰瘍創(chuàng)面病程長達20～136d，均經久不愈，從經驗判斷非植皮難以愈合，應用rhEGF治療后，平均用藥（16.63±9.54)d，全部治愈。另有上海長海醫(yī)院應用rhEGF治療燒傷創(chuàng)面，同樣取得明顯療效。

（F)給藥途徑與劑量

rhEGF給藥途徑和劑量是影響其藥效發(fā)揮的重要因素。在以往的研究中，幾乎所有的研究者均采用局部給藥方法。當皮下給藥時，進入血循環(huán)的速度受到大分子量、低細胞透性及注射位點可能存在的酶降解因素的影響。因此，局部給藥途徑是最為快捷、簡便而有效的方法。rhEGF局部給藥所得結果不盡一致，有人以2.5g/ml濃度用于角膜創(chuàng)傷有明顯的促進愈合作用。有人研究指出，rhEGF在10～100g/ml濃度范圍內促角膜創(chuàng)傷愈合作用呈劑量依賴性。通過適當的載體將外源rhEGF進行體表局部給藥時，從理論上講，組織中rhEGF只要達到4ng/（g·h)的劑量即可發(fā)揮最大刺激效果。但由于1臨床應用時影響因素較多，如創(chuàng)面感染程度、分泌物等因素，均可使rhEGF活性降低。因此，臨床最佳劑量尚需在臨床研究中結合rhEGF劑型及創(chuàng)面的具體情況來決定，才能保證其最佳臨床療效。

（G)安全性

由于rhEGF與內源EGF的結構、活性有著高度的一致性。國內外對rhEGF的安全性研究結果均未發(fā)現有免疫反應。rhEGF與其受體的結合存在著飽和機制的負反饋作用，不致引起靶細胞過度增生，未見組織、角膜、血管過度增生現象。國內中山大學對 rhEGF的安全性進行了全面系統(tǒng)的毒理、特殊毒理研究，亦充分證明了它的安全性。目前為止還沒有證據表明應用rhEGF后引起瘢痕增生和癌變。Chester等早期所做的有關致癌實驗表明，rhEGF雖可刺激癌變細胞的增殖，但不會引起正常組織癌變。在Ⅱ期臨床試驗中亦未見與本品有關的不良反應，因此高純度的．rhEGF局部處理各類創(chuàng)面是較為安全的。

創(chuàng)傷愈合是燒、創(chuàng)傷治療中的一個重要環(huán)節(jié)。過去往往需用抗感染藥物、敷料覆蓋等措施等待創(chuàng)面自然愈合，周期較長，易感染，影響治療效果。rhEGF的發(fā)現與生產，為創(chuàng)傷領域提供了新的治療途徑。將基因技術引入燒創(chuàng)傷創(chuàng)面治療，可縮短創(chuàng)面愈合時間，提高愈合質量。這一臨床應用研究成果在近日第九屆中美燒傷學術會上得到國際燒傷學會主席樸魯特教授及與會專家的好評。

rhEGF用于角膜損傷、潰瘍及角膜缺損有其特殊療效，用于燒傷各類創(chuàng)面的治療顯著縮短愈合時間，已在臨床初步得到證實。隨著研究的不斷深入，rhEGF在胃潰瘍、口腔潰湯、糜爛性陰道炎、鼻粘膜潰瘍等創(chuàng)面的治療方面將有巨大的開發(fā)潛力和臨床應用價值。目前正通過rhEGF基因轉染技術，即通過基因工程使患者表皮細胞自身分泌生長因子，將轉基因生長因子與細胞培養(yǎng)復合移植技術結合起來，可望解決大面積燒傷病人的皮膚來源稀少問題，減少手術次數，加速創(chuàng)面愈合，把創(chuàng)面愈合的治療提高到一個新水平。

（八)神經生長因子

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是至今為止發(fā)現的唯一不僅對中樞及外周神經的正常神經細胞有營養(yǎng)因子作用，而且具有調節(jié)損傷神經修復機能的生物活性分子。近年來，對其研究方興未艾。臨床醫(yī)生對此產生了越來越濃厚的興趣。下面概要介紹其有關情況。

（A)NGF的概念

1948年Bucker用小雞肉瘤180及肉瘤37勻漿接種培養(yǎng)雞胚時發(fā)現，其中有生物活性物質能使雞胚的背根節(jié)變大。以后，Levi-Montalcini分析了這一物質，并提出這種能促進神經生長的物質應稱為nerve growth factor (NGF)，但未提純和深入分析，直到1960年S．Cohen用生化方法純化了NGF蛋白，并證明它確有NGF的生物活性，因此，他們兩位(Levi-Montalcini和S．Conhen)獲得了1986年諾貝爾醫(yī)學獎。到1970年又分析出由小鼠頜下腺提純的NFG是個復合蛋白，其中有兩個亞基，兩個g亞基和一個b亞基，總分子量約為130000，沉降系數為7S�，F陸續(xù)又從人胎腦、胎盤、精囊等分析出了 NGF也是一個復合蛋白。但通過生物性質分析得知NGF的活性實際上僅存在于p亞基上 (只有118個氨基酸)。故NGF現在大多只指其中的b亞基，又可稱為b-NGF，其沉降系數為2.5S，這時的NGF就可認為是單純蛋白質。目前用基因工程生產的都是b-NGF多肽，其產品在個別國家已逐步應用于臨床。

（B)NGF的組成、來源及受體分布

1．組成

中性pH時，應用離子交換層析技術可以從富含NGF的組織勻漿中分離出具有三種亞基(、b、g)NGF。分子量為130000—140000，沉降系數為7S。該復合蛋白含有一個或兩個鋅離子，鋅濃度可影響其穩(wěn)定性。亞基分子量約26000，等電點約4.3，它司抑制7SNGF中的丁亞基活性，在機體內起保護NGF作用；g亞基分子量約26000，等電點約5.5，由229個氨基酸殘基構成，是精氨酸特異的酯肽酶，是b—NGF在細胞中基因表達加工時結合上的。它有分解NGlPb亞基的能力；b亞基可完全表現NGF的生物活性，它是由兩條相同的單鏈借非共價鍵連接而成的二聚體，每一單體由118個氨基酸組成，亞基分子量約26000，等電點9.3，在分離NGF過程中產物的裂解都發(fā)生在亞基上，Bocchini和Angeletti應用Varo等的簡化方法得到一種裂解和未裂解的混合產物，稱為 2.5SNGF，它不但具有NGF的生物活性，而且g亞基羧基精氨酸的丟失阻礙了其與了亞基的結合。

 2．來源

NGF來源于神經的靶器官(如肌肉、腺體等)以及膠質細胞(外周神經雪旺細胞和纖維細胞)。含有豐富NGF的組織有成年雄性小鼠頜下腺、精液、蛇毒和豚鼠前列腺等，人體中含量均非常低微，腦組織中只及小鼠頜下腺的十萬分之一。不同來源的NGF結構基本相同(7SNGF差異大一些)，但它們有一定的交叉免疫反應。故用于病人的產品還是來源于人體的NGF最好。制備方法有粗制(7SNGF)和精制(2.5SNGF)兩種。

3．分布

NGF受體(NGFR)分布于所有的神經細胞，但在一些非神經細胞的胞膜上也發(fā)現了NGFR，例如雪旺細胞、淋巴濾泡樹突狀細胞、肌上皮細胞、血管外膜、口腔粘膜和毛濾泡的基底上皮細胞、人B細胞和T細胞等。

（C)NGF的生物學效應與作用機制效應

（1)促進神經細胞生長  ①能使感覺神經，交感神經節(jié)數目增加，體積增大，纖維延長，對正常細胞起營養(yǎng)因子作用；②促使神經原分化、發(fā)育、軸突的生長；③對損傷神經起修復營養(yǎng)作用；④促進分化、發(fā)育，使不成熟的成熟，故有抗腫瘤效應。

（2)增強特異及非特異免疫反應  在許多免疫細胞上存在NGFR。①NGF可使B細胞DNA合成增強，免疫球蛋白(Ig)合成增加；②可提高T細胞活性和促進淋巴細胞增殖；③可促使結締組織肥大與腸粘膜肥大細胞生長和組胺釋放增加。

（3)增強生育能力 成年雄鼠頜下腺NGF含量高于雌鼠10倍左右，雌鼠注射睪酮后NGF含量增加，去勢雄鼠NGF含量減少，可能雄性激素與頜下腺NGF含量有關。實驗證明發(fā)育中的卵巢能轉錄NGF基因，并把mRNA翻譯成NGF。NGF通過其對神經的營養(yǎng)作用調節(jié)卵巢發(fā)育而獲得雌性生殖能力

2．機制

詳盡的使用原理有待進一步探討，大致原理已明確。①NGF的靶細胞膜上存在高親合力和低親和力兩種受體。這兩種類型的NGFR可通過控制內化過程中受體位置而相互轉化。 NGF通過一系列過程，內化轉運核周體，進而與細胞核受體結合產生效應；②NGF使內源性cAMP增加；NGF和cAMP均可增強細胞間和細胞與支持物間粘著，提高膽堿乙酰轉移酶和鳥氨酸脫羧酶活性，促進神經生長，同時NGF也能激活cGMP磷酸二酯酶。還有其他機制如：促進微絲的表達，增加蛋白激酶，引起胞內某些代謝指標的變化。

（D)NGF的臨床應用

l．范圍

（1)神經系統(tǒng)發(fā)育不良  ①弱視；②腫瘤包括雪旺細胞瘤、神經纖維瘤等神經性瘤、黑色素細胞瘤。

（2)神經萎縮  ①視神經萎縮；②青光眼；③早老性癡呆；④享丁頓舞蹈��；⑤神經性耳聾；⑥腦萎縮。

（3)神經修復  各種神經損傷，如腦外傷后的恢復和后遺癥、脊髓損傷、斷肢再植、脊髓移植、腦梗死、腦血管意外等。

（4)神經系統(tǒng)變性疾病  ①運動神經元��；②帕金森��；③脊髓小腦變性等。

（5)促進傷口愈合和增強生育能力

2．方法及劑量

①肌注 量要大，目前還不清楚NGF的作用方式，但小劑量無明顯效果。這里說的大劑量是指500～1000U，特別是腦部疾患，雖然有實驗證實有確切作用，但不知其是如何通過血腦屏障的。

②局部應用  眼科的球后注射、椎管注射、腦室注射、損傷部位注射以及手術區(qū)域注射等，其機理已基本清楚，劑量可小一些。

3．國內外應用情況

主要用于腦外傷、癲癇、周圍神經損傷，取得了較好的效果。其次應用于眼科、腦外科、神經內科、骨科、創(chuàng)傷科等。對神經損傷效果之好令人驚異，對青光眼能改善視力及視野。

NGF用于臨床的誘人前景將會到來，大量的動物實驗結果豐富了對NGF作用的認識。諾貝爾獎獲得者Levi-Montlini說，NGF的臨床應用有著迷人的希望，NGF不僅對神經系統(tǒng)，而且對內分泌和免疫系統(tǒng)都發(fā)揮著重要的作用，是一種能抵抗疾病的全能武器。NGF的發(fā)現，使許多疑難病病因找到了答案，為神經生物學這個新興學科奠定了基礎。